Сайт использует файлы cookie. Продолжая пользоваться нашим сайтом, вы соглашаетесь на использование нами ваших данных.
Узнать больше
Принять и продолжить
анализ биотеха

Транспозоны на службе у человека

От функциональной геномики до генной инженерии

Алексей Ржешевский, Дора Батаева, Юлия Ким
18 мая 2021
Рис.1. Мобильные генетические элементы в геноме человека. Источник.
Мобильные генетические элементы (МГЭ, или транспозоны) были открыты ещё в середине прошлого века Нобелевским лауреатом Барбарой Макклинток. Как это часто бывает с важными открытиями, МГЭ вначале не привлекли к себе особого внимания научного мира. Считаясь долгое время просто накопившимся генетическим «мусором». Пока спустя полвека не появились современные технические методы, позволившие описать важную роль транспозонов в эволюции, физиологии и патологии организмов. Как метко выразился один из лидеров в изучении МГЭ, американский эволюционный биолог Седрик Фешотт, «развитие геномики и крупномасштабных функциональных анализов пролило новый свет на многогранную активность МГЭ и показало нам, что они больше не должны считаться «маргиналами» [1].

Сегодня известно, что МГЭ составляют как минимум половину генома человека. Ученые традиционно делят их на два класса из-за разных молекулярных механизмов, при помощи которых эти элементы перемещаются по ДНК: ДНК-транспозоны и ретротранспозоны.
Мобильные генетические элементы (МГЭ) — последовательности ДНК, которые могут перемещаться внутри генома.
Ретротранспозоны (или ретроэлементы) — более молодой класс МГЭ, которые до сих пор проявляют свою активность в геномах многих организмов. В том числе — и у человека, в геноме которого они составляют подавляющее большинство мобильных элементов, более 40%.

Для своего перемещения ретротранспозоны используют механизм обратной транскрипции. На что указывает приставка «ретро-» в их названии. Сам процесс обратной транскрипции был открыт в 1970 году двумя Нобелевскими лауреатами, американскими учеными Говардом Темином и Дэвидом Балтимором. В ходе него образование ДНК происходит на основании информации из РНК, которая здесь выступает матрицей. Кроме ретроэлементов, этот механизм для своего размножения используют и ретровирусы. Характерно, что фермент обратная транскриптаза задействована как в перемещении ретротранспозонов, так и в теломерах (теломеразе). У дрозофил, единственный пока описанный уникальный случай, когда роль теломеразы напрямую исполняют ретротранспозоны [2].
ДНК-транспозоны — более древние. И из-за накопившихся мутаций уже утратили свою активность в геномах млекопитающих (за редкими исключениями, такими, как летучие мыши). Для своего перемещения они используют механизм, который получил название «cut and paste» (вырезать и вставить). Что удивительно и важно для нашего обзора, в геномике сегодня используется в основном не активные «молодые» ретроэлементы, а более «древние» неактивные ДНК-транспозоны. И связано это как минимум с двумя причинами. Во-первых, ДНК-транспозоны не делают своих копий, а действительно перемещаются по геному, имея в своем арсенале фермент, специально «заточенный» для таких перемещений. И при своих передвижениях ДНК-транспозоны, такие, как используемые генетиками транспозоны Tc1/mariner, не зависят от факторов организма «хозяина», действуя автономно. Полагаясь, так сказать, на свои силы. В том числе не зависят и от энергии в виде АТФ. Потому что энергия, необходимая для их интеграции, поступает в ходе реакции расщепления целевой ДНК. Что позволяет ученым использовать эти элементы в генетических манипуляциях, оживляя древние реликты из нескольких копий.
Как же происходит перемещение ДНК-транспозонов?
Рис. 2. Схематическое изображение перемещения транспозона с помощью механизма «вырезать и вставить».
Эти элементы имеют в своей структуре ген, кодирующий специальный фермент, транспозазу. После активации гена синтезированная транспозаза перемещается вдоль ДНК и находит на ней свой транспозон по специальным меткам (инвертированным повторам), ограничивающим его с обеих сторон. Найденный транспозон вырезается транспозазой, перемещается в другое место и вставляется в вырезанную брешь. И на заключительном этапе происходит процесс репарации ДНК в месте встраивания транспозона.

Существует ещё несколько видов уникальных ДНК-транспозонов. Таких, как элемент гелитрон, который для своего перемещения использует принципиально иной механизм, названный rolling-circle (катящийся круг). А также гигантские (по геномным меркам) ДНК-транспозоны полинтон, которые кодируют до 10 белков (в том числе ретровирусную интегразу) и имеют сходство с вирусами. Как показали исследования, полинтоны произошли от линейной плазмиды, которая приобрела ретровирусную интегразу около 1 миллиарда лет назад. Транспозиция полинтона тоже имеет свои особенности. Молекула ДНК полинтона, вырезанная из генома, служит матрицей для внехромосомного синтеза своей двухцепочечной ДНК-копии с помощью закодированной в структуре полинтона ДНК-полимеразы и вставляется обратно в геном с помощью своей интегразы.
Эти виды мобильных элементов, гелитрон и полинтон, были открыты в 2000-х годах известным первооткрывателем транспозонов Владимиром Капитоновым с коллегами [3,4].

Надо отметить, что российские исследователи немало потрудились над открытиями траспозонов. Ещё в 70-х годах прошлого века первыми обнаружив мобильные элементы у многоклеточных. И сегодня продолжают их открывать, что хорошо нам показывают собственные имена транспозонов, взятые у героев гражданской войны и сказочных персонажей: Kolobok, Novosib, Chapaev, Transib, Academ, Avrora (в честь крейсера) и др.
Удивительно, но фермент транспозаза, при помощи которого и происходит перемещение транспозона, оказался универсальным средством для создания иммунной системы живых организмов. Причем как у позвоночных, так и у бактерий. У позвоночных транспозаза древних транспозонов Тransib около 500 млн. лет назад стала основой для появления белков RAG, необходимых для иммунного механизма V(D)J-рекомбинации. Это открытие было также сделано упоминавшимся выше В. Капитоновым. У бактерий же древняя транспозаза транспозона, названного каспозон, стала основой для знаменитой сегодня системы иммунитета прокариот CRISPR-Cas. Что обнаружил ещё один известный российский ученый-вирусолог Евгений Кунин с коллегами.

Кунин тоже особо отметил факт участия транспозонов в создании иммунитета живых организмов: «Вероятный вклад каспозонов в эволюцию CRISPR-Cas параллелен участию транспозазы RAG1 в перестройке гена иммуноглобулина позвоночных. И это показывает, что привлечение эндонуклеаз мобильных элементов в качестве готовых инструментов для манипуляции геномом является общим путем эволюции адаптивного иммунитета». Позже Е.Кунин с коллегами описали ещё несколько заимствований у транспозонов, благодаря которым окончательно сформировалась система иммунитета у прокариот. А также одно обратное заимствование, о котором мы расскажем чуть позже [5,6].

И вот теперь генетики поставили транспозоны на службу в геномике.
Примечательно, что для мобильных элементов описаны случаи не только вертикального наследования, от родителей к потомству, но и горизонтального переноса между разными особями и даже разными видами. Горизонтальный перенос позволяет транспозонам продолжить свой жизненный цикл и не исчезнуть совсем в результате мутаций с течением времени. Так как их транспозиция не требуют определенных факторов от организма «хозяина», у них не должно быть проблем с приживаемостью в новом месте. Был описан ряд случаев горизонтального переноса различных МГЭ между морскими животными насекомыми из разных отрядов, а также между организмами из разных видов, такими, как человек и нематода [7–10].

Пока не до конца понятно, как мобильные элементы могут проникать в новые геномы. Потенциальными переносчиками, которые могут участвовать в горизонтальном переносе, выступают внешние паразиты, такие как клещи и вирусы [11,12].
Ещё один возможный механизм горизонтального переноса ретротранспозонов открыли в 2007 году российские биологи из МГУ, Л. Нефедова и А. Ким. Они описали, как один из ретротранспозонов в геноме дрозофилы D. melanogaster приобрел характерный вирусный ген env. После чего превратился в ретровирус и смог перемещаться горизонтально, от дрозофилы к её эндосимбионту (микроорганизму, живущему внутри дрозофилы) — бактерии Wolbachia pipientis [13].

В 2015 году Z. Tang с коллегами обнаружили факты горизонтального переноса ДНК-транспозонов между насекомыми, пресноводными планариями (червями) и летучими мышами [14].

И совсем недавно, в 2019 году японские ученые описали еще один возможный способ горизонтального переноса ретротранспозонов LINE-1 [15].

В 2020 году китайские и французские биологи в своей работе проанализировали 307 геномов позвоночных и обнаружили несколько сотен независимых событий горизонтального переноса между эволюционными линиями, которые разошлись в ходе эволюции более 120 миллионов лет назад [16].

Как мы уже говорили выше, уникальные свойства транспозонов, связанные с их перемещением и автономностью, обратили на себя внимание генетиков. Которые с начала 2000-х годов взяли их на вооружение в своих экспериментах и исследованиях.
В каком качестве транспозоны могут применяться в генетических исследованиях?
Во-первых, их можно использовать в таком научном направлении, как функциональная геномика, занимающаяся изучением функций генов. Все то огромное количество генов в геноме и еще более огромное количество продуктов, которые они синтезируют, требует описания их функции. Говоря научным языком — решения проблемы функциональной аннотации каждого гена и разработки генетических сетей и путей. Для этого ученые разными методами проводят генетический функциональный скрининг для создания мутантных фенотипов путем инсерционного мутагенеза. Звучит немного сложно. Но в сущности это внедрение в геном чужеродной ДНК для изменения активности генов (повышения или понижения активности), с целью проанализировать последующие за этим изменения. Так, вставка транспозона в открытую рамку считывания (ORF) вызывает мутацию с потерей функции.

В другом варианте, вставка транспозона, несущего сильный промотор, может напротив, активировать экспрессию. И последующее выявление фенотипов, связанных с мутационным изменением активности определенных генов, позволяет описывать их функции.

Даже из этого короткого описания можно увидеть, насколько это непростая (прямо скажем — сложная) работа. И транспозоны её сильно облегчают.
Мутация генов посредством вставки отдельных частей чужеродной ДНК имеет, по мнению генетиков, по крайней мере два преимущества перед другими стратегиями мутагенеза.

Во-первых, вставка чужеродной ДНК обычно связана с более сильной мутагенной нагрузкой, чем точечная мутация, тем самым генерируя более устойчивые фенотипы.

Во-вторых, вставленный фрагмент ДНК может служить уникальной молекулярной меткой, которая позволяет быстро методом ПЦР идентифицировать мутировавший аллель [17].
Этот подход, кроме всего прочего, имеет немалую ценность в экспериментах с целью идентификации генов, связанных с онкогенезом. Которые успешно проводятся на животных моделях с применением транспозонов Sleeping Beauty и PiggyBac. Причем на этот подход ученых навели полученные ещё в конце прошлого века данные об участии ретровирусов в онкогенезе, посредством вызываемого ими инсерционного мутагенеза. Когда интеграция провируса вызывает специфические генетические повреждения и активацию эндогенных онкогенов [18,19].
Ещё одно важное направление, связанное с транспозонами и мутагенезом — это изучение генома патогенных бактерий. Для того, чтобы выявлять гены, связанные с их инфекционностью и эффективнее воздействовать на патоген. Такой, к примеру, как известная бактерия H. Pylori. Или исследование генома посредством транспозонного мутагенеза полезных бактерий, таких, как цианобактерии. Которые активно изучаются для применения в химической и фармацевтической промышленности [20,21].

Ещё одно направление использования транспозонов в геномике — это трансгенез (то есть искусственное введение в организм чужеродного гена, трансгена). И тут для использования транспозонов открывается довольно широкое поле для применения. Первыми здесь нашли свое применение вирусные векторы. Но, как уже известно, у использования вирусных векторов имеются некоторые ограничения. Связанные с их иммуногенностью и малой грузоподъёмностью, что препятствует переносу более крупных генов. Также производство вирусных векторов — дело дорогостоящее и требует больших материальных затрат. Что и послужило причиной в качестве замены им рассматривать альтернативные методы. И транспозоны тут как раз пришлись очень кстати.
Этот подход, кроме всего прочего, имеет немалую ценность в экспериментах с целью идентификации генов, связанных с онкогенезом. Которые успешно проводятся на животных моделях с применением транспозонов Sleeping Beauty и PiggyBac. Причем на этот подход ученых навели полученные ещё в конце прошлого века данные об участии ретровирусов в онкогенезе, посредством вызываемого ими инсерционного мутагенеза. Когда интеграция провируса вызывает специфические генетические повреждения и активацию эндогенных онкогенов [18,19].

Ещё одно важное направление, связанное с транспозонами и мутагенезом — это изучение генома патогенных бактерий. Для того, чтобы выявлять гены, связанные с их инфекционностью и эффективнее воздействовать на патоген. Такой, к примеру, как известная бактерия H. Pylori. Или исследование генома посредством транспозонного мутагенеза полезных бактерий, таких, как цианобактерии. Которые активно изучаются для применения в химической и фармацевтической промышленности [20,21].

Ещё одно направление использования транспозонов в геномике — это трансгенез (то есть искусственное введение в организм чужеродного гена, трансгена). И тут для использования транспозонов открывается довольно широкое поле для применения. Первыми здесь нашли свое применение вирусные векторы. Но, как уже известно, у использования вирусных векторов имеются некоторые ограничения. Связанные с их иммуногенностью и малой грузоподъёмностью, что препятствует переносу более крупных генов. Также производство вирусных векторов — дело дорогостоящее и требует больших материальных затрат. Что и послужило причиной в качестве замены им рассматривать альтернативные методы. И транспозоны тут как раз пришлись очень кстати.

Первое, что выгодно отличало эти элементы — их хорошая грузоподъёмность. Для трансгенеза в генной инженерии необходимо переносить немало всего. Трансгенные конструкции включают в себя кодирующие области генов со всеми необходимыми элементами регуляции транскрипции. И могут составлять несколько тысяч пар оснований (т.п.о). Транспозоны, такие как PiggyBac, Tol2 и Sleeping Beauty, как раз и могут переносить трансгенные грузы большого размера.
На рисунке представлен транспозон «Sleeping Beauty» и его транспозиция. (А) Компоненты «Sleeping Beauty». Элемент имеет один ген, кодирующий транспозазу, который окружен терминальными инвертированными повторами (IR/DRs, синие стрелки), каждый из которых содержит два сайта связывания для транспозазы (маленькие зеленые стрелки). (B) Транспозиция. Ген транспозазы в элементе может быть заменен терапевтическим геном, и полученный транспозон может поддерживаться в простом плазмидном векторе.
Как это заведено в научном мире, для трансгенеза и инсерционного мутагенеза транспозоны вначале «обкатывали» на беспозвоночных моделях, червях C. elegans и дрозофилах. Прорыв в этом направлении случился в 1997 году. Когда немецкие генетики, Zoltаn Izsvаk с коллегами, «воскресили» древний транспозон из суперсемейства Tc1/mariner. Он был собран по частям из нескольких геномов рыб и назван в честь сказочной героини Sleeping Beauty (Спящая красавица). Вот как об этом вспоминали позже ученые: «Взяв за основу несколько транспозонов в геномах рыб, которые были активны более 10 миллионов лет назад, древний транспозон был буквально пробужден нами после долгого эволюционного «сна» и назван Sleeping Beauty в честь героини знаменитой сказки. Sleeping Beauty стал первым транспозоном, который показал способность переносить гены в клетках млекопитающих. Тем самым открывая новые возможности для генетических манипуляций на модельных животных, а также для генной терапии человека» [22].

Сегодня Sleeping Beauty (SB) наиболее широко используется генетиками в качестве генетического инструмента. SB демонстрирует активность у различных видов, от простейших до позвоночных, включая лягушек, рыб, мышей, крыс и людей. В 2009 году команда Z. Izsvаk, «воскресившая» SB, создала на её основе гиперактивную версию, SB100X. Которая показала 100-кратное увеличение эффективности в переносе генов по сравнению с первым поколением транспозаз SB [23].

SB используют сегодня в исследованиях по переносу генов у позвоночных (в соматической и половой линии), в эмбриональных стволовых клетках и других культивируемых клеточных линиях. Преимущества SB включают ее пониженную иммуногенность и хорошие профили безопасности. По сравнению с ретровирусными системами, SB- векторы обладают низкой энхансерной и промоторной активностью. И вызывают незначительные эпигенетические изменения в сайте встраивания в геноме. В целом, как считают генетики, хромосомная интеграция транспозонов SB показала себя довольно точной и без побочных эффектов [24].

Хотя Sleeping Beauty в настоящее время самый популярный объект для исследований в качестве инструмента по переносу генов, другие транспозоны из этого же семейства, Tc1/mariner, «подтягиваются» вслед за ней. Удивительным образом «оживая» из древних осколков в геномах для дальнейшего использования в качестве геномных инструментов. Так, транспозон, названный в честь ещё одного сказочного героя из сказки братьев Гримм, Frog Prince, был реконструирован из лягушки Rana pipiens. Эксперименты с ними показали, что для него характерна высокая транспозиционная активность в клетках позвоночных. Что позволяет ученым рассматривать его как ещё один инструмент в генной инженерии. Ещё один транспозон, Minos, был выделен из генома Drosophila hydei. [25,26].

А транспозон Himar1 был реконструирован из генома мухи Haematobia Irans и активно использовался в скринингах посредством инсерционного мутагенеза для идентификации генов, участвующих в патогенности бактерий [27,28].
На рисунке представлен транспозон PiggyBac
Второй по популярности транспозон в работах генетиков после Sleeping Beauty — это ДНК-транспозон piggyBac из того же суперсемейства Tc1/mariner. piggyBac был идентифицирован в геноме капустной моли. На основе piggyBac была сконструирована транспозаза, которая показала хорошую активность в клетках разных организмов. Начиная от простейших и насекомых и заканчивая млекопитающими, в том числе и человека [29-31].

И что важно, piggyBac хорошо подходит как инструмент модификации вредных насекомых путем внедрения в их геном гены летальности или стерильности, с целью борьбы с ними [32].

Характерной особенностью piggyBac по сравнению с вирусными векторными системами выступает его способность доставлять до 100 т.п.н. груза ДНК (для сравнения, у вирусных векторов — до 8 т.п.н.). А модифицированный piggyBac -транспозон смог обеспечить доставку гена в бактериальную искусственную хромосому (BAC) размером 200 т.п.н. для генерации трансгенной модели. Поэтому система переноса на основе piggyBac может нести трансгены относительно большого размера, как, к примеру полноразмерный ген дистрофина (один из самых больших генов в человеческом организме), для эффективной генной терапии. Что было затруднительно при использовании вирусных векторов [33,34].

У млекопитающих инструменты на основе piggyBac использовалась в различных исследованиях, связанных с зародышевым и соматическим мутагенезом, и в генной терапии. А также для создания индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК). И это ещё одно перспективное и важное направление, связанное с транспозонами. Так как применение ИПСК может сыграть существенную роль в борьбе со старением и возрастными патологиями, скажем о нем несколько слов.
Долгое время считалось, что соматические клетки, дифференцированные (то есть получившие специализацию) в ходе эмбрионального развития организма невозможно вернуть в первоначальное стволовое состояние. К концу прошлого века уже было известно несколько транскрипционных факторов, необходимых для поддержания состояния плюрипотентности (то есть возможности дифференцироваться в любые типы клеток): это Oct3/4, Sox2 и Nanog. Позже к ним добавились и другие факторы. Ставший впоследствии знаменитым Нобелевский лауреат Шинья Яманака со своей командой протестировал 24 из известных в то время транскрипционных фактора. Как показали результаты его исследования 2006 года, для получения из мышиных фибробластов ИПСК достаточно было ввести в их геном всего 4 фактора: Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc. В 2007 году тоже самое им удалось проделать и с человеческими фибробластами [35].
Факторы транскрипции (транскрипционные факторы) — белки, контролирующие процесс синтеза мРНК, а также других видов РНК на матрице ДНК (транскрипцию) путём связывания со специфичными участками ДНК.
Что же это за чудо-факторы?
Транскрипционный фактор Oct3/4

Является ключевым фактором в регуляции плюрипотентности. При нокауте этого гена мышиные эмбрионы погибают на стадии бластоцисты. Oct4 также является классическим протоонкогеном, и нарушение его экспрессии приводит к формированию различных типов опухолей. Во взрослом здоровом организме активность Oct4 очень низкая.


Транскрипционный фактор Sox2

Sox2 (SRY — sex determining region Y-box2) относится к членам Sox-семейства транскрипционных факторов, участвующих в регуляции разных этапов клеточного развития и дифференцировки. Данная группа белков действует в регуляции транскрипции и архитектуры хроматина. Sox2 образует комплекс с Oct4, участвующий в регуляции экспрессии генов UTF1, Fgf4, Fbx15, необходимых для поддержания плюрипотентности эмбриональных стволовых клеток. Эмбрионы с нокаутом гена Sox2 погибают на ранней стадии. Sox2 также является протоонкогеном. Мутации в этом гене приводят к врождённым порокам развития.


Транскрипционный фактор Klf4

Klf4 относится к семейству транскрипционных факторов Kruppel-like. Белки этого семейства вовлечены в ряд процессов, таких, как эмбриональное развитие, клеточная пролиферация, дифференцировка и апоптоз. В экспериментах на мышах было описано последовательное увеличение экспресии гена Klf4 во время эмбрионального развития. Вначале экспрессия Klf4 обнаруживается в экстраэмбриональных тканях, затем в желудочно-кишечном тракте и после этого — в развивающихся слоях кожи эмбриона.

Во взрослом организме Klf4 продолжает экспрессироваться в желудочно-кишечном тракте, коже и в терминально дифференцированных эпителиальных тканях. Характерной особенностью Klf4 выступает высокий уровень его экспрессии в неделящихся клетках и полное отсутствие в активно пролиферирующих клетках. Эмбрионы мышей с нокаутированным геном Klf4 нормально развиваются, но гибнут вскоре после рождения из-за дефекта в защитной функции кожи. В отличие от Oct4 и Sox2, Klf4 может действовать и как возможный онкоген, и как опухолевый супрессор.

В 2017 году японские исследователи показали, что Klf4 критически важен метаболического сдвига: подавления митохондриального окислительного фосфорилирования и перехода на гликолиз. Что характерно для стволовых клеток.

В 2019 году эта же команда ученых описала механизм подавления ретротранспозонов в ИПСК. Которые, как известно, имеют особенность активироваться в некоторых стволовых клетках: «Мы обнаружили, что подавление ретровирусов происходило относительно рано в процессе репрограммирования, до развития плюрипотентности, и не требовало использования KLF4. Затем мы исследовали белки, связанные с сайтом связывания праймера заглушенных провирусов, где происходит сайленсинг. Был идентифицирован новый компонент сайленсинга, TAF-Iα. Нокдаун или сверхэкспрессия TAF-Iα приводили к уменьшению или усилению сайленсинга ретровируса, соответственно. Предполагая его важную роль в подавлении ретровирусов во время репрограммирования клеток» [36,37].


Транскрипционный фактор с-Мyc


С-Мyc — транскрипционный фактор, участвующий в процессах пролиферации, дифференцировки и клеточного роста. Было описано участие с-Мус в регуляции транскрипции более 10% всех известных генов. По предположительным расчетам у него может быть более 2500 сайтов связывания по всему геному человека. Кроме прямого связывания с ДНК, c-Myc ещё влияет на работу гистон-ацетилтрансферазы — фермента, модифицирующего структуру хроматина Кроме регуляции транскрипции белок-кодирующих генов, с-Мyc участвует в регуляции генов микро-РНК.

Эмбрионы мышей с нокаутированным геном с-myc имеют нормальное развитие на начальных этапах. Но на поздних стадиях появляются нарушения в развитии сердца, нервной трубки, сосудов и клеток крови. Что приводит к смерти эмбрионов на 10 день после оплодотворения. Примечательно, что эмбриональные стволовые клетки с нокаутированным с-myc нормально пролиферируют и способны к самообновлению. Как и все остальные факторы из «списка» Яманаки, с-Мyc является протоонкогеном.

Сегодня ИПСК (индуцированные плюрипотентные стволовые клетки) активно изучают во многих лабораториях. Есть несколько потенциальных направлений, связанных с клиническим применением ИСПК. Зная их способность превращаться в любые типы клеток, сразу напрашивается на применение заместительная клеточная терапия с использованием ИПСК при патологиях, связанных с потерей клеток. Как к примеру, при нейродегенерации. Также их можно применять при тестировании новых лекарственных средств и создании клеточных моделей заболеваний человека. Как это уже сделано, к примеру, с клеточной моделью болезни Паркинсона [38].

Кроме всего прочего, ИПСК могут нам помочь в борьбе со старением. Так, в 2019 году американские биологи из университета Джона Хопкинса описали, что внеклеточные везикулы, секретируемые ИПСК содержат важные антиоксидантные ферменты, пероксиредоксины. Эксперименты на клеточных культурах показали их возможное потенциальное применение в борьбе со старением клеток. Причем, как показало сравнение количества внеклеточных везикул из ИПСК и другого вида популярных стволовых клеток, мезенхимальных (МСК), ИПСК секретировали везикул в 16 раз больше, чем МСК. И это открытие может иметь немалую ценность. Так как предыдущие исследования показали, что везикулы, продуцируемые и секретируемые МСК человека, могут заменять сами МСК в терапии по восстановлению и регенерации тканей [39].

Но, вернемся к нашим транспозонам. В первоначальных работах Ш. Яманака и другие исследователи использовали для введения в геном индуцирующих плюрипотентность факторов ретровирусные и лентивирусные векторы. Как альтернатива вирусным векторам в последние годы стала развиваться невирусная доставка генов при получении ИПСК посредством ДНК-транспозонов.

Как показали исследования, транспозоны могут быть эффективными инструментами для клеточного репрограммирования нескольких типов клеток при получении ИПСК.

Системы переноса на основе элементов piggyBac и Sleeping Beauty использовались для генерации ИПСК как в клетках человека, так и различных животных. Таких, как мыши, крысы, свиньи лошади летучие мыши, обезьяны и др. Производство ИПСК из клеток животных очень важно для создания моделей болезней и производства некоторых веществ для применения в медицине. Таких, как ферменты и гормоны роста, которые нужны людям, страдающим определенными генетическими заболеваниями [40].

При этом клеточное репрограммирование с помощью транспозонных систем позволяет в последующем удалять трансген и получать «свободные от трансгена» ИПСК. Что важно для уменьшения риска реактивации факторов репрограммирования. Которые, как мы помним из их описания, все имеют онкогенный потенциал.

Но это ещё не всё. Кроме получения ИПСК, транспозонные системы показали свой потенциал перепрограммировании и других видов стволовых клеток. Тут надо отметить, что со стволовыми клетками сегодня связаны немалые надежды в лечении различных заболеваний. После генетической манипуляции на основе транспозонов по введению нужного гена, стволовые клетки могут быть размножены in vitro (вне организма, в клеточной культуре) и затем подвергнуты дифференцировке в определенные клеточные линии в соответствии с конкретной терапевтической надобностью. Сегодня уже имеются данные, показывающие надежный, вызванный транспозоном перенос генов в нескольких клинически значимых типах стволовых клеток. Таких, как эмбриональные стволовые клетки, CD34+ гемопоэтические стволовые клетки (ГСК), МСК и миобласты [41].

И что важно, инструменты на основе транспозонов имеют перспективы по коррекции генов в стволовых клетках из-за их большей безопасности, по сравнению с вирусными методами. Которые в клинических испытаниях приводили к серьезным побочным реакциям, таким, как инсерционный онкогенез [42].

Так, к примеру, в одном из исследований транспозон-опосредованный перенос генов интерферона IFNγ в МСК использовали в модели меланомы на мышах. И было показано, что экспрессирующие IFNγ МСК, вживленные в строму опухоли, ингибируют рост опухоли и ангиогенез, а также улучшают выживаемость мышей [43].
Схема Т-клеточной терапии CAR
Ещё один тип терапии, сегодня очень активно изучающийся и связанный с перепрограммированием транспозонами, это применение химерных антигенных рецепторных Т-клеток (CAR Т-клеток). Многие наверное уже слышали о CAR Т-клетках в связи с их применением иммуноонкологии. Технология, основанная на химерных антигенных рецепторах (CAR), позволяет генерировать Т-клетки, нацеленные практически на любую существующую структуру белка на любой клетке. Для иммуноонкологии Т-клетки созданы с помощью генной инженерии, чтобы экспрессировать CAR, который распознает антигены раковых клеток. Затем CAR Т-клетки идентифицируют раковые клетки и выводят их из организма.

В 2020 году эксперименты с CAR Т-клетками также показали их потенциал в качестве нового класса сенолитиков.

Клинические испытания терапии CAR на основе Т-клеток стремительно развиваются. И каждый год количество запросов на одобрение клинических испытаний всё увеличивается. В 2016 г. во всем мире было зарегистрировано около 200 клинических испытаний терапии CAR Т-клетками при различных злокачественных новообразованиях [44].

Сегодня, по данным ClinicalTrials.gov, проходят более 600 клинических испытаний на различных этапах терапии CAR Т-клетками. Большинство клинических испытаний по-прежнему сосредоточено на гематологических злокачественных новообразованиях. В большинстве текущих клинических исследований для производства CAR Т-клеток использовались вирусные векторы.

Но сегодня уже существуют как вирусные, таки невирусные методы производства CAR Т-клеток.
Вирусные векторы сейчас широко используются в производстве CAR Т-клеток. Но этот метод производства имеет свои существенные недостатки. Во-первых, возможность онкогенного и мутагенного потенциала требует более стабильного вектора, который в конечном итоге будет использоваться для получения CAR Т-клеток клинического уровня. Во-вторых, использование вирусов в лабораториях связано с рядом строгих правил. В-третьих, лентивирусная и ретровирусная трансдукция ограничена малой грузоподъёмностью транспортируемой ДНК, о чем мы уже говорили выше. И в целом стоимость производства вирусных векторов гораздо выше, чем стоимость их аналогов на основе транспозонов. И потому невирусные методы переноса генов могут быть более приемлемыми для производства клинического уровня.

Поэтому для применения транспозонов здесь открывается широкая дорога. И они уверенно по ней «зашагали» своими воображаемыми ногами.

Так, система на основе транспозона Sleeping Beauty. в настоящее время используется в качестве замены вирусным векторам при получении, например, CD19 + CAR Т-клеток с противоопухолевой активностью как in vitro, так и in vivo [45].

Основным преимуществом этого метода выступает более качественная интеграция трансдуцированного генетического материала. Что достигается за счет более низкой промоторной активности интегрированного транспозона. Системы Sleeping Beauty. также вызывают гораздо меньше эпигеномных изменений в непосредственной близости от сайта интеграции [46].

В 2019 году Z. Ivics с коллегами разработали новый модифицированный вариант транспозазы Sleeping Beauty. Он имеет несколько улучшенных характеристик, в том числе повышенную стабильность и способность проникать в клетки. Вот как об этом пишут авторы: « Одним из наиболее явных преимуществ новой технологии является то, что она позволяет производить транспозазу в промышленных масштабах в фармацевтических целях. Что делает систему доставки генов Sleeping Beauty еще более привлекательной для будущих терапевтических применений. На данный момент наша новая процедура клеточной инженерии дешевле в исполнении и приведет к снижению затрат. А за счет повышения точности и контроля метода — к повышению безопасности модификаций генома, значимых с медицинской точки зрения» [47].

Система транспозонов PiggyBac также может применяться для производства CAR Т-клеток. И были успешно опробованы для генерации различных CAR Т-клеток [48-50].

Сегодня уже имеется несколько клинических испытаний по терапевтическому применению CAR Т-клеток, произведенных с помощью транспозонов [51-54].

В 2021 году к КИ по применению CAR Т-клеток, произведенных с помощью транспозонов, подключился и создатель Sleeping Beauty Z. Ivics со своей командой. В одном из журналов Nature вышел отчет его команды о первом клиническом испытании по применению SLAMF7 CAR-T-клеток. Они были получены безвирусным переносом посредством системы Sleeping Beauty для лечения множественной миеломы. Все это происходит в рамках созданного проекта CARAMBA. Консорциум CARAMBA состоит из десяти партнеров из шести стран ЕС. В него входят четыре передовых клинических центра в области клинической помощи и исследований миеломы: Университетская клиника Вюрцбурга (Германия), больница Сан-Рафаэле (Италия), университет Наварры (Испания) и Региональный госпитальный центр и университет Лилля (Франция). Среди других партнеров проекта — институт Пауля Эрлиха (Федеральный институт вакцин и биомедицинских препаратов, Германия), биотехнологические компании NBE-Therapeutics (Швейцария), и T-CURX (Германия). А также французский провайдер управления проектами ARTTIC SAS. Европейская комиссия выбрала проект CARAMBA из большого числа высококонкурентных проектных предложений в рамках конкурса «Инновационные методы лечения редких заболеваний» в программе исследований и инноваций Horizon 2020 [55].
Ну и напоследок — «изюминка» в исследованиях транспозонов. Самые последние разработки по совместному применению транспозонов с системой CRISPR-Cas.

Вначале мы уже рассказывали об открытии Е.Кунина, показавшего происхождение системы прокариотического (то есть у архей и бактерий) иммунитета CRISPR-Cas от транспозонов. Но на этом дело не закончилось. Неутомимый Е.Кунин с коллегами через несколько лет после своего первого открытия описали ещё один примечательный факт. Как оказалось, эволюция в своем неспешном движении может пройти полный круг: дав вначале основу для возникновения иммунной системы у прокариот, другие транспозоны впоследствии приобрели систему CRISPR-Cas для лучшей своей интеграции в геномы [56].

Поначалу факт наличия у транспозонов иммунной системы CRISPR-Cas вызывал у исследователей недоумение. Зачем геномным «паразитам» средство защиты от паразитов? От кого им защищаться? В итоге выяснилось, что они приспособили этот механизм для лучшего проникновения в геномы. В 2019 году американские ученые подробно описали интеграцию транспозонов посредством адаптированной CRISPR-Cas. Федор Урнов (из Института инновационной геномики, Беркли, Калифорния) в своей статье в Nature довольно образно сравнил такой поворот в эволюции транспозонов с гамлетовской историей: «Когда Гамлет смертельно ранен отравленным клинком Лаэрта в их поединке, он берет оружие противника и наносит ответный удар. Убивая Лаэрта его собственным мечом. S. Klompe с коллегами описывают столь же драматическую смену оружия в биологической войне. Они показали, что молекулярная машина под названием Cascade (один из вариантов CRISPR-Cas), которую бактерии используют для защиты от генетических захватчиков, также может быть использована против них некоторыми из этих захватчиков» [57,58].

Понятно, что мимо такого факта не могли пройти исследователи, занимающиеся генной инженерией. Объединить транспозоны с CRISPR-Cas для более совершенного редактирования генома — такая идея напрашивалась сама собой. И вскоре она была уже реализована. В том числе и командой Евгения Кунина. Примечательно, что ещё начиная с 2014 года, предвосхитив будущие открытия, две группы исследователей создали систему для редактирования ИПСК, объединив нуклеазу Cas9 с транспозоном piggyBac. В результате чего удавалось не только эффективно переносить трансген, но и бесследно удалять его, когда это было необходимо [59-63].
Биотех компании, разрабатывающие терапий на основе CAR Т-клеток, произведенных с помощью транспозонов
ZIOPHARM Oncology Inc

  • ziopharm.com
  • NASDAQ: ZIOP
  • Personalized TCR-T: Ziopharm создает персонализированную клеточную терапию, используя Sleeping Beauty для генетической модификации Т-клеточных рецепторов (TCR) и нацеливания их на опухолевые антигены (неоантигены), которые уникальны для каждого организма. Возвращаясь в тело пациента, такие измененные клетки смогут идентифицировать опухолевые клетки по неоантигенам и уничтожать их [64].
Рисунок с сайта компании
  • 3rd gen CD19 with mblL15: CAR-T рецептор 2 поколения, нацеленный на CD19. Относится к 2 поколению, так как имеет 2 костимулирующих домена (чем больше костимулирующих доменов, тем быстрее клетка активируется и пролиферирует) [65].
  • Промежуточные результаты показали, что 26 пациентов с неходжкинской лимфомой и лейкозом благополучно перенесли трансплантацию гемопоэтических стволовых клеток и инфузию CAR-T-клеток в качестве адъювантной терапии (терапия, которая усиливает иммунный ответ) в аутологичных (n=7) или аллогенных условиях (n=19).
    • после аутологичной трансплантации (трансплантация собственных клеток) 30-месячная выживаемость без прогрессирования и общая выживаемость составили 83% и 100% соответственно.
    • после аллогенной трансплантации (трансплантация чужих клеток) 12-месячная выживаемость без прогрессирования и общая выживаемость составили 53% и 63% соответственно [65].
  • Биоинженерный подход состоит из 3 компонентов:
1
С помощью CAR программируют T-клетки так, чтобы они могли атаковать CD19, который экспрессируется на поверхности злокачественных B-клеток. (CD19 экспрессируется на всех B-клетках, но с превращением В-клеток в плазматические клетки происходит утрата CD19-рецепторов. И маркером для определения рака является экспрессия на плазматических клетках CD19.
2
Затем привязывают интерлейкин 15 (IL15) к мембране T-клеток. IL15 помогает в пролиферации (разрастании) Т-клеток, тем самым дает им преимущество в выживании.
3
Далее вставляют в ДНК переключатель, позволяющий при необходимости деактивировать модифицированные T-клетки.
Precigen Inc.

  • precigen.com
  • NASDAQ: PGEN
  • UltraCAR-T: Precigen используют Sleeping Beauty для генетической модификации CAR-Т-клеток. Эта терапия с высокой эффективностью может доставлять несколько антигенов, которые нацелены на разные мишени. И выбираются эти антигены индивидуально для каждого человека. UltraCAR-T сконструированы так, что экспрессируют антиген-специфичные CAR, kill switch (переключатель, который деактивирует модифицированные Т-клетки) и mbIL15 [66].
Рисунок с сайта компании
  • На данный момент Precigen проводят 2 клинических исследования с использованной терапии UltraCAR-T: PRGN-3005 для лечения рака яичников и PRGN-3006 для миелодиспластического синдрома (МДС) и острого миелоидного лейкоза (ОМЛ) [67].
CoImmune, Inc.

  • www.coimmune.com
  • Не торгуется на бирже
  • CAR-CIK: Colmmune использует невирусный метод переноса генов и Cytokine Induced Killer (CIK), а не T-клетки.
  • Промежуточные результаты клинического исследования показали, что 7 (78%) из 9 пациентов с острым лимфобластным лейкозом достигли полной ремиссии на 28-й день [68,69].
NBE Therapeutics

  • www.nbe-therapeutics.com
  • Не торгуется на бирже
  • NBE-Therapeutics разрабатывает NBE-002 (anti-ROR1 iADC). Это конъюгат антитело-лекарственное средство, нацеленное на связанный с опухолью рецептор ROR1. iADC — это молекула антитела, к которой химически присоединены цитотоксины (противоопухолевый препарат). iADC нацелены на уничтожение опухолевых клеток, при этом сохраняют здоровые клетки и вызывают длительный противоопухолевый иммунитет.
  • Одна из проблем, связанная с разработкой iADC, — качество мишени и свойства нацеленного антитела. Для решения этой проблемы NBE-Therapeutics разработала платформу Transpo-mAb Display для обнаружения и оптимизации антител против соответствующей опухолевой мишени. Платформа Transpo-mAb Display основана на генерации стабильной транспозиции (перемещения) ДНК для лучшего нацеливания на опухолевые клетки-мишени [70]. Также платформа ускоряет процесс скрининга антител, устраняя необходимость в промежуточном секвенировании [71].
T-CURX

  • t-curx.com
  • Не торгуется на бирже
  • T-CURX участвует в проекте Европейской комиссии — CARAMBA.Европейская комиссия в рамках своей программы Horizon 2020 выбрала для финансирования проект CARAMBA. Комиссия поддерживает проект в течение 4 лет с финансированием в размере 6,1 миллионов евро. Один из партнеров этого проекта — компания T-CURX [72].
  • Ключевой целью проекта CARAMBA является предоставление клинических доказательств концепции безвирусной передачи гена с использованием передовой технологии Sleeping Beauty. CARAMBA в качестве мишени для клеток CAR-T на основе Sleeping Beauty выбрал мишень — SLAMF7, который экспрессируется при множественной миеломе [73].
Bristol-Myers Squibb
(разработку терапии ввела компания Juno Therapeutics, но с 2019 года Juno Therapeutics принадлежит Bristol-Myers Squibb)

  • www.breyanzi.com
  • BREYANZI — одобренная FDA CAR-T терапия, нацеленная на CD19, индуцирует активацию T-клеток CAR и убивает клетки-мишени. В отличие от других, компания Bristol-Myers Squibb использует вирусный вектор для доставки генетического материала в CAR-T клетки.
  • Результаты: Breyanzi продемонстрировал 73% общего ответа (ORR) и 54% полного ответа (CR) [74].
Hera BioLabs

  • https://www.herabiolabs.com
  • Не торгуется на бирже
  • Hera BioLabs помогает исследователям создавать клеточные модели для имитации и изучения болезней. Комбинация Cas-CLOVER™ (для целевого редактирования, альтернатива CRISPR) и транспозазы piggyBac® (для доставки генов) обеспечивает возможности для создания моделей.
  • Транспозон piggyBac — это невирусный метод стабильного введения нуклеиновых кислот в клетки эукариот, постоянной вставки трансгенов (фрагментов нуклеиновых кислот) [75]. Одним из главных преимуществ системы piggyBac является ее способность стабильно доставлять несколько трансгенов одновременно при одном введении [76].
Tessera Therapeutics

  • www.tesseratherapeutics.com
  • Не торгуется на бирже
  • Tessera Therapeutics разрабатывает новый класс редакторов генов, способных точно вставлять длинные участки ДНК, — чего CRISPR не может.
  • Gene Writing™: используя функции Mobile genetic elements (MGEs) "вырезать", "скопировать" и "вставить", Tessera Therapeutics разрабатывает генетические манипуляторы, которые могут быть использованы для лечения болезней, возникающих из-за ошибок в геноме.
  • С момента своего создания с 2018 году Tessera занимается поиском этих MGEs в последовательностях геномов тысячи видов бактерий и модифицирует их, чтобы создать новые редакторы генов, способные производить любой желаемый белок. После этой модификации MGE можно вводить в желаемую ткань с помощью липидных наночастиц или векторов AAV (вирусных векторов), которые в конечном итоге будут вырезать, копировать или вставлять фрагменты ДНК, кодирующие белок, в любом месте генома [77].
Список литературы
1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6240941/
2. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21821789/
3. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1450207/
4. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/11447285/
5. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4046053/
6. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5737515/
7. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/16690328/
8. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/12654937/
9. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/7476131/
10. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2041818/
11. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/1653453/
12. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/9442899/
13. https://www.elibrary.ru/item.asp?id=9562976
14. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4298943/
15. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6691892/
16. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7070016/
17. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5682939/
18. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26051241/
19. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/8639705/
20. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC529078/
21. https://www.pnas.org/content/112/48/E6634
22. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/9390559/
23. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19412179/
24. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3971908/
25. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC290277/
26. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC58754/
27. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1393221/
28. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2075046/
29. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1919496/
30. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1275597/
31. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2677165/
32. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/16776846/
33. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3574282/
34. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4737162/
35. https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(07)01471-7?_returnURL=https%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS0092867407014717%3Fshowall%3Dtrue
36. https://www.cell.com/stem-cell-reports/fulltext/S2213-6711(17)30042-5?_returnURL=https%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS2213671117300425%3Fshowall%3Dtrue
37. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2211124719313038
38. https://www.fbras.ru/wp-content/uploads/2017/10/Novosadova_Grivennikov.pdf
39. https://stemcellsjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/stem.2996
40. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7415244/
41. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6408843/
42. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18688285/
43. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25428727/
44. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5582407/
45. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30793967/
46. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/10802653/
47. https://www.nature.com/articles/s41587-019-0291-z
48. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2796278/
49. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4948190/
50. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6278070/
51. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5004935/
52. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31961918/
53. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32780725/
54. https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04289220
55. https://www.nature.com/articles/s41434-021-00254-w
56. https://www.pnas.org/content/114/35/E7358
57. https://www.nature.com/articles/d41586-019-01824-0?fbclid=IwAR1QSbnPMz7QkNZeQ4Iw4IoJw30RQnHLiglh9noxBh-xzPLOmruM3PdutWE#author-0
58. https://www.nature.com/articles/s41586-019-1323-z
59. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5352979/
60. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4158758/
61. https://science.sciencemag.org/content/365/6448/48
62. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31355344/
63. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6919251/
64. https://ziopharm.com/t-cell-therapy/tcrs-for-solid-tumors/
65. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5004935/
66. https://precigen.com/science/#therapeutic-platforms
67. https://precigen.com/pipeline/
68. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7598053/
69.https://www.coimmune.com/news/press-releases/chimeric-antigen-receptor-car-modified-cytokine-induced-killer-cell-car-cik-technology-featured-at-ash/
70. https://www.nature.com/articles/d43747-020-00577-4
71. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26986818/
72. https://www.caramba-cart.eu
73. https://www.nature.com/articles/s41434-021-00254-w
74.https://news.bms.com/news/details/2021/U.S.-Food-and-Drug-Administration-Approves-Bristol-Myers-Squibbs-Breyanzi-lisocabtagene-maraleucel-a-New-CAR-T-Cell-Therapy-for-Adults-with-Relapsed-or-Refractory-Large-B-cell-Lymphoma/default.aspx
75. https://www.herabiolabs.com/cell-line-engineering/
76. https://biotech-365.com/transposagen-piggybac-transposon-system/
77. https://geneonline.news/en/tessera-therapeutics-aims-to-rewrite-dna-with-new-age-gene-manipulators/
comments powered by HyperComments