Углеродная долина

Еще недавно мысль о том, что генная терапия может навсегда остаться «лекарством будущего» и так не попасть в продажу, могла показаться простительной. Однако сегодня это «будущее» наконец-то становится реальностью за счет разрешений на клеточную и генную терапию, таких как терапия химерного антигена (CAR) Т-клетками, разработанными для иммунотерапии рака фирмами Kite Pharma (ныне входит в Gilead Sciences) и Novartis, а также терапия дистрофии сетчатки глаза — voretigene neparvovec (Luxturna) от компании Spark Therapeutics.

В то же время, эти прорывы специфичны для узкого круга заболеваний. Нам до сих пор недостает некоей «plug-and-play» системы, которая смогла бы поставлять нужные компоненты в любую заданную ткань или клетку. Именно эту задачу ставит перед собой Sana Biotechnology.

По словам президента и генерального директора Стива Харра (Steve Harr), цель компании заключается не менее чем в разработке стратегий, позволяющих восстановить или заменить любую клетку в организме. «Речь идет не о том, чтобы попытаться создать некий единый инструмент, — говорит Харр. — Мы работаем над созданием целого набора инструментов». На начальном этапе мы практикуем двусторонний подход. С одной стороны компания занимается созданием «универсальных», не вызывающий иммунного отторжения стволовых клеток, которые могут быть использованы в регенеративной медицине, и параллельно с этим ищет новый метод целенаправленной генетической модификации клеток и тканей in vivo.

Для достижения этих целей компания привлекла к работе множество ветеранов клеточной и генной терапии. Одним из первых в команду влился Ричард Маллиган (Richard Milligan) — один из отцов-основателей генной терапии. Маллиган считает разработки компании уникальными. «После 30 лет работы в этой области, своей единственной настоящей неудачей я считаю неспособность предоставить этой чисто теоретической научной технологии практический способ применения», — говорит он. В частности, он был поражен тем, что компания отметает узкие задачи и фокусируется на разработке широких платформенных технологий.

В 2019 году Sana Biotechnology получила финансирование в размере $219 млн. от таких спонсоров как ARCH Venture Partners, Flagship Pioneering и F-Prime Ventures, и уже оценивается более чем в $1 млрд. Помимо Маллигана, который является вице-президентом совета директоров, руководство фирмы укомплектовано специалистами по клеточной и генной терапии из компании Juno Therapeutics, одной из первых компаний, приступившей к клиническому развитию CAR T-клеток. Среди них Харр, бывший финансовый директор и глава корпоративного развития, а также руководитель отдела исследований и разработок Сунил Агарвал, занимающий ту же должность в компании Juno Therapeutics.

Академические исследования играют основополагающую роль в технологическом портфеле компании, прежде всего, в области производства универсальных стволовых клеток. Стратегия компании в области развития клеточных технологий опирается на работу соучредителя и бывшего сотрудника Гарвардского института стволовых клеток Чада Коуэна, а также Сони Шрепфер из Калифорнийского университета в Сан-Франциско, которая в настоящее время возглавляет платформу Hypo-Immune в Sana.

Эти программы сфокусированы на создании индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), т. е. клеток, генетически перепрограммированных для входа в состояние, близкое к эмбриональным, но без сопутствующих юридических и этических проблем. Такие клетки могут быть генетически модифицированы нужным образом и дифференцированы в целый ряд зрелых типов клеток, потенциально пригодных для трансплантации. Проблема заключается в том, что если трансплантированные клетки не будут получены из собственных тканей пациента (что является очень трудоемким и дорогим процессом), они почти наверняка будут отторгнуты его иммунной системой. «Практически, в любой точке вашего тела иммунная система готова уничтожить результаты очень дорогой клеточной терапии, — объясняет Трейси Грикшайт (Tracy Grikscheit), детский хирург, специализирующийся на регенеративной медицине в детской больнице Лос-Анджелеса. — Согласно некоторым свидетельствам, даже аутологичные клетки могут подвергаться атаке иммунной систему». В связи с этим, на ранней стадии развития терапии ИПСК основное внимание уделялось таким заболеваниям как макулярная дегенерация глаза или болезнь Паркинсона, поскольку целевые ткани в этих случаях менее подверженны иммунной реакции.

Стратегия иммунной маскировки, используемая группой Шрепфер (Sonja Schrepfer), предполагает использование редактирования генома с помощью CRISPR для удаления генов, кодирующих компоненты основного комплекса гистосовместимости (MHC), при одновременном увеличении производства белка, называемого CD47, который защищает клетки от уничтожения макрофагами и дендритными клетками. По словам Харра, таким образом обеспечивается двухсторонняя защита этих клеток. «Обычно воздействие на адаптивную иммунную систему ухудшает ответ врожденного иммунитета, — говорит Харр. — Соня придумала способ модификации клеток, полностью скрывающий их от обеих ветвей иммунной системы».

Группа Кован (Cowan) пошла еще дальше, внеся дополнительные модификации CRISPR для индуцирования экспрессии запрограммированного лиганда клеточной смерти 1 (PD-L1), иммуносупрессивного белка, подавляющего аутоимунные реакции, а также белка, называемого человеческим лейкоцитарным антигеном G (HLA-G). HLA-G защищает плод от отторжения иммунной системой матери во время беременности, а также и на поверхности модифицированных ИПСК. «Это прекрасная комбинация: одновременно клетки маркируются как «свои», а маркеры «уничтожения» удаляются», — говорит Грикшайт (Tracy Grikscheit).

Впрочем, до настоящего времени эти подходы тестировались только на мышах и на клеточных культурах, соответственно, еще многие вопросы остаются нерешенными. Грикшайт отмечает, что спектр факторов, определяющих иммунную переносимость и отторжение, по-прежнему плохо изучен, и что победить в этой гонке вооружений будет непросто. «Чем сильнее вы перепрограммируете клетки, тем выше вероятность того, что они не будут следовать заданной вами программе», — говорит она. Окончательные ответы даст только тестирование на более сложных животных моделях и, в конечном счете, на людях. У пересадки скрытых от иммунной системы клеток могут оказаться непредвиденные последствия, например, они могут спровоцировать развитие опухолей или распространению инфекций. «Целесообразно было бы иметь некий способ контроля за клеткой, — говорит Харр, — например, клеточную «кнопку самоликвидации»».

Несмотря на эти сомнения, выгода успешной маскировки может оказаться огромной. Если мы сможем производить универсальные стволовые клетки в промышленных масштабах, генетически модифицированные донорские ткани станут широкодоступными для лечения целого ряда заболеваний. «Мы не фокусируемся на экзотических и редких проблемах. Наша работа сосредоточена на клетках, которые могли бы оказать серьезное влияние на лечение таких распространенных заболеваний, как болезни сердца, печени, или диабета», — говорит Маллиган.

Однако клеточная терапия — не единственное направление, выбранное компанией. Компания также ищет возможности для коммерциализации новой стратегии целевой доставки генов, разработанной приобретенной ею фирмой Cobalt Biomedicine. Эта стратегия использует т.н."фюзогены" — ретровирусные или лентивирусные частицы, встроенных в липидный бислой, для доставки интересующего гена к определенным типам клеток.

Маллиган рассматривает эту технику как возможную альтернативу стратегиям генной терапии, основанным на трансплантации генетически модифицированных гемопоэтических стволовых клеток. Эта терапия требует сложных процедур извлечения и культивирования донорских клеток костного мозга, а также изнурительного лечения химиотерапией или облучением для уничтожения уже существующих стволовых клеток и подготовки реципиента к трансплантации. «Мне кажется, мы сделали больше пересадок костного мозга мышам, чем кто-либо другой в этом мире. Как же замечательно было бы покончить с этим и иметь возможность действовать напрямую через некий вирус», — говорит Маллиган.

Фузогенная платформа и платформа замаскированных стволовых клеток еще не прошли клинических испытаний, но Маллиган очень взволнован будущими перспективами. Он возглавляет подразделение компании, известное как SanaX, которое фокусируется на технологиях, применимых в течение пяти-десяти лет и очень благодарен Харру и остальным руководителям за то, что они сосредоточились на практическом внедрении новых технологий. Маллиган говорит: «У нас пока нет больших мощностей, но зато есть первоклассная группа, готовая обеспечить производство лентивирусных или гипоиммунных клеток, как только они понадобятся».

Харр осознает риски, связанные с развитием новых технологий клеточной и генной терапии. На ближайшие пару лет он поставил перед собой цель доработать и испытать платформу "Сана" в доклинических исследованиях, а в идеале — получить достоверные данные из экспериментов на животных для обоснования подготовки к испытаниям на людях. «Я не ожидаю, что наш путь будет простым, — говорит он, — но если мы все сделаем правильно, наша работа действительно будет иметь смысл».

С тех пор, как развитие рака было связано с генетическими мутациями, исследователи стремились использовать это знание на практике. Еще в начале 1990-х годов профессор онкологии Университета Джона Хопкинса Фогельштейн разработал мутационную модель рака. «Большинство людей до сих пор думают, что если вы разбираетесь в мутациях, то можете разработать и терапию, — говорит он. — К сожалению, это не так».

Фогельштейн выступает за стратегию раннего выявления заболевания, используя мутации в качестве биомаркеров для выявления раковых заболеваний до стадии метастазирования, когда они все еще могут быть вылечены хирургическим путем. Стремление разработать простой, неинвазивный тест на выявление раковых клеток стимулировало появление большого количества инноваций. Например, так называемые «жидкостные биопсии» заключаются в проверке на наличие онкомаркеров таких телесных жидкостей, как кровь или моча. Однако за счет сравнительно невысокой чувствительности до сих пор эти тесты были наиболее пригодны только для выявления реакции рака на терапию или для раннего предупреждения рецидива.

Цель CancerSEEK — это выявление рака путем анализа циркулирующих ДНК и белковых биомаркеров в крови еще до появления первых симптомов. Используя алгоритм машинного обучения, изобретатели подготовили программное обеспечение для оценки комбинации мутаций ДНК и панели белковых биомаркеров, чтобы определить, где возможное место развития онкологии.

Так же как и здоровые, раковые клетки высвобождают свободную ДНК в кровоток. Тест Thrive частично базируется на способности обнаружить онкогенные мутации в циркулирующей в крови ДНК. Сложность этого подхода заключается в том, что на ранней стадии заболевания концентрация мутировавшего ДНК может быть чрезвычайно низка — порядка одной мутантной молекулы на каждые 10 000 здоровых. Несмотря на то, что инструменты параллельного секвенирования обеспечивают высокую пропускную способность, необходимую для обнаружения этой одной молекулы, их погрешность все же слишком высока для надежного подтверждения мутации.

«Если вы хотите обнаружить рак с помощью такого подхода, вы должны уметь различать редкие раковые мутации и фоновые артефакты самого процесса секвенирования», — говорит Исаак Кинде (Isaac Kinde).

Кинде разработал метод решения этой проблемы. «Система безопасного секвенирования снижает частоту фоновых ошибок, за счет чего обнаружение мутаций становится более надежным», — объясняет он. Система предусматривает маркировку отдельных шаблонных молекул ДНК с помощью уникальных идентификаторов и их последующую амплификацию. Если в исходной ДНК присутствует мутация, то эта же мутация проявится в каждой молекуле, содержащей идентификатор. Мутации, которые будут внесены позже, будут видны на соответственно меньшей части маркированных цепочек ДНК.

Когда поиск «иголки в стоге сена» стал возможен, возник следующий вопрос: сколько разных иголок стоит искать? Если протестировать слишком малое количество мутаций, многие опухоли останутся незамеченными. Проверяя слишком большое их количество, вы увеличиваете шанс ложноположительного результата, а кроме того, и стоимость теста.

В научной публикации 2018 года, впервые описывающей тест CancerSEEK, Фогельштейн и его коллеги из компании Johns Hopkins анализируют способность теста выявлять восемь различных типов рака — рак яичника, печени, желудка, поджелудочной железы, пищевода, толстой кишки, легких или молочной железы — у пациентов с поставленным диагнозом рака с 1-й по 3-ю стадию. Основываясь на этой работе, количество тестируемых генов было ограничено до 16, что является хорошим компромиссом между повышением чувствительности и снижением специфичности теста.

В отличие от других находящихся в разработке «жидких биопсий», CancerSEEK сочетает в себе анализ мутаций и белковых биомаркеров, что позволяет повысить специфичность теста и определить пораженную ткань. Тест оценивает 1 933 различных геномных позиций и 8 белковых биомаркеров, включая CA-125, карциноэмбриональный антиген (CEA), миелопероксидазу и пролактин.

«Больше всего в их подходе меня впечатлила мысль о том, что нет ни одного теста, подходящего для всех», — комментирует Пьер Массион (Pierre Massion) из Ракового центра Вандербильт Инграм (Vanderbilt Ingram Cancer Center) в Нэшвилле, штат Теннесси. «Я думаю, что совмещение разных подходов для достижения одной цели — хорошая идея», — говорит он. Однако Массион также предупреждает, что белковые биомаркеры являются информативными только в том случае, если они протестированы в правильном контексте. «Если вы разработали некий биомаркер в контексте прогрессирующей болезни, при этом пытаетесь протестировать его же на ранних стадиях, вы с большей вероятностью потерпите неудачу», — говорит он.

И действительно, в том первом исследовании на 1 005 пациентах, CancerSEEK успешно выявил только 43% онкологических заболеваний 1-й стадии по сравнению с 76% заболеваний 2-й и 78% заболеваний 3-й стадии. «Мы никогда не получим прямого попадания, но разработки движутся в правильном направлении», — говорит Массион, — это очень захватывающе».

На данный момент множество компаний работают над различными подходами к проблеме ранней диагностики рака. Компания Guardant Health уже предлагает использовать анализ крови для определения лечения у пациентов с прогрессирующим онкологическим заболеванием. Сейчас она набирает пациентов в экспериментальную группу с целью раннего обнаружения рака толстой кишки. В марте этого года стартап Grail опубликовал результаты исследования с участием 6 700 человек, в котором посредством анализа крови были успешно выявлены 50 различных типов рака. Общая чувствительность теста составила 44% для рака 1–3 стадии. Этот тест выявляет раковую ДНК, циркулирующую в крови, на основе уникальных схем метилирования, отличающих ее от ДНК здоровых клеток.

Thrive Earlier Detection начала свою деятельность в мае 2019 года с потрясающего финансирования в размере $110 мнл., полученного в ходе инвестиционного раунда А от топ инвесторов во главе с Third Rock Ventures. «Люди из Third Rock прочитали нашу публикацию и очень заинтересовались, — вспоминает Фогельштейн. — Они посчитали, что таким образом мы сможем изменить жизнь многих людей к лучшему».

«Это сразу привлекло мое внимание», — вспоминает Стив Кафка (Steve Kafka), который в то время был венчурным партнером в Third Rock Ventures. «Я просто мгновенно ухватился за эту возможность, потому что, во-первых, это очень важная проблема и, во-вторых, у нас наконец-то появился научный подход, который будет клинически и коммерчески жизнеспособен». С 2013 по 2018 год Кафка занимал пост президента Foundation Medicine. Он подписал инвестиционный контракт с фирмой в качестве генерального директора-основателя компании Third Rock Ventures, которым он оставался до августа 2019 года. В настоящее время Кафка является председателем совета директоров Thrive, а также управляющим партнером другого инвестора компании Section 32.

Недавно Thrive Earlier Detection завершила большое предварительное исследование, проверяющее работу теста в реалистичных условиях. Исследование DETECT-A было проведенно совместно с компанией Geisinger Health. В нем участвовали 10 000 женщин в возрасте 65–75 лет, у которых никогда не был диагностирован рак. Публикация результатов ожидается в ближайшее время.

«Нашим следующим большим шагом будет проведение полномасштабного исследования для получения регистрации FDA», — говорит Дэвид Дэйли (David Daly), с августа 2019 года занимающий пост генерального директора Thrive. Несмотря на то, что еще не все детали исследования определены, уже известно, что в нем примут участие как женщины, так и мужчины, которые составят гораздо более широкую и репрезентативную экспериментальную группу.

Одним из критических результатов для DETECT-A будет доля ложноположительных тестов. Из-за белковых биомаркеров, которые могут сигнализировать о не связанных с раком заболеваниях, тест иногда дает ложноположительный результат. В то время как предварительное исследование сравнивало пациентов больных раком со здоровыми людьми, обычный скрининг будет означать тестирование более широкого круга лиц, некоторые из которых могут иметь другие медицинские показания.

«Есть уровни белка, которые могут быть весьма значимыми, но не специфичными для рака», — отмечает Кинде. Миелопероксидаза, например, ассоциируется с воспалением вследствие целого ряда заболеваний. «Наш анализ биомаркеров сфокусирован на достижение высокой специфичности, но он не идеален», — говорит он.

Кинде также указывает на то, что некоторые из «ложных срабатываний» на самом деле могут оказаться истинными, но просто пока ещё не поддающимися проверке обычными методами диагностики. CancerSEEK может распознать рак, возникший практически в любой части тела, однако получение положительного результата еще не означает, что источник опухолевой ДНК найден. В большинстве случаев тест способен сузить поиск опухоли до двух органов, однако точность анализа варьируется в зависимости от типа рака, из-за чего необходима дополнительная диагностика.

«Тест считается ложноположительным в том случае, если вы не можете определить местонахождение опухоли при последующем изучении снимков, — говорит Кинде, добавляя, — «на самом же деле, не исключено, что CancerSEEK может обнаружить болезнь столь ранней стадии, что обычные методы диагностики просто не обладают достаточной чувствительностью для подтверждения этого результата. Насколько это предположение соответствует действительности, станет ясно только из анализа данных лонгитудинальных исследований».

Еще одно препятствие, с которым Thrive придется встретиться — это проблема включения теста в рутинную клиническую практику. Для облегчения этой задачи фирма дополнительно разрабатывает интегрированный сервис, который будет помогать врачам и пациентам в процессе анализа и последующей проверки полученного результата. Для того, чтобы тест стал полезен, его результаты должны был понятны как врачам, так и пациентам.

«CancerSEEK разработан с учетом его интеграции в рутинную практику, — говорит Кафка. — Он прост в использовании, финансово доступен и надежен, за счет чего мы надеемся как на поддержку регулирующих инстанций, так и практикующих медиков». Кафка ожидает, что специфика теста и его экономическая эффективность заинтересуют больничные кассы, в то же время признавая, что «заставить Medicare или частных страховщиков начать использовать что-то новое — нелегкая задача».

«Я не думаю, что они думают о себе как о компании, продающей тест, —говорит Фогельштейн о Thrive. — Своей задачей они считают лечение онкологии». Ключевой посыл для пациентов заключается в том, что этот анализ должен будет дополнять, а не заменять собой рекомендованные скрининг-тесты. «Мы ни в коем случае не хотим, чтобы пациент отказывался от, скажем, маммографии, на основании негативного анализа крови».

«Главная цель академических стартап-компаний, — говорит Фогельштейн, — это превращение интересных открытий в практически полезные продукты, доступные широкой публике. Вот почему так важно, чтобы промышленность работала совместно с учеными, и я думаю, что Thrive является прекрасным примером подобного сотрудничества».

Сейчас, в разгаре пандемии коронавируса все внимание общественности сосредоточено на разработчиках вакцин. Существуют разные подходы к созданию противовирусных вакцин: от простейших вакцин, состоящих их инактивированных частиц вируса, до современных разработок, основанных на генетической информации. И тем не менее, вакцин от некоторых вирусов до сих пор так и не удалось создать. Примером такого неподатливого вируса является вызывающий пневмонию респираторно-синцитиальный вирус (RSV), который до сих пор уносит жизни 160 000 человек в год. В настоящее время исследователи Института Дизайна Белков (IPD) Университета Вашингтона создали самособирающуюся наночастицу, которая, как показали предварительные эксперименты на животных, более чем в десять раз повышает активность антител против RSV. Эта разработка послужила основой для создания в Сиэтле стартапа Icosavax, который надеется с ее помощью решить некоторые из самых сложных проблем с вакцинами.

«Самые крутые, самые удивительные белки — это те белки, которые собираются сами по себе», — говорит Нил Кинг (Neil King) из IPD, соавтор ключевой работы Cell paper, который сейчас председательствует в научно-консультативном совете Icosavax. «Если мы сможем разрабатывать новые самособирающиеся белки, это станет ключевым шагом на пути к созданию новых молекулярных машин, которые будут настроены под конкретные области применения».

Компьютерная программа под названием Rosetta, созданная в лаборатории Дэвида Бейкера (David Baker) в IPD в конце 1990-х годов и с тех пор постоянно совершенствуемая всемирным консорциумом участников, позволяет исследователям проектировать синтетические белки, посредством первоначального определения искомой трехмерной структуры. Ранние версии программы могли предсказывать структуры белков на основе их аминокислотной последовательности, но за 20 лет непрерывного развития ее возможности значительно расширились. И хотя петли и боковые цепи в крупных белках все еще представляют проблемы, к 2012 году Rosetta уже могла предсказывать нужную аминокислотную последовательность, которая сложится в желаемую конформацию. «Магия этой технологии заключается в том, что мы можем работать с точностью до атомного уровня», — говорит Кинг.

За счет этой высокой точности Кинг смог еще больше усовершенствовать технологию и получил возможность проектировать пары пептидов, самоорганизующихся в сложную четвертичную структуру. «Мы используем программное обеспечение для моделирования трехмерной структуры белковых субъединиц, — говорит он, — а затем проектируем новые белково-белковые интерфейсы между субъединицами, собирающими целевую структуру».

«Как только у нас появилась возможность проектировать самособирающиеся наноматериалы, мы сразу же решили применить их на благо общественного здравоохранения», — говорит Кинг. — Эта технология очень хорошо подходит для создания вакцин».

Одной из своих задач компания Icosavax видит создание вакцины от респираторно-синцитиального вируса человека (RSV), который особенно опасен для маленьких детей в развивающихся странах, не имеющим доступа к такому современному медицинскому оборудованию, как механические вентиляторы легких. Первые испытания вакцины RSV закончились трагедией, отбросив подобные исследования на десятилетия назад. Вакцина, изготовленная на базе вирусного препарата, разрушенного формалином, не только не смогла защитить младенцев от инфекции, она еще и ухудшила ее протекание. В то время как госпитализация понадобилась 5% заболевших детей из контрольной группы, 80% из заболевших вакцинированных детей вынуждены были отправиться в госпиталь и, как это ни трагично, двое из них умерли. Причина такого исхода оставалась загадкой до 2009 года, когда исследователи сообщили, что проблема оказалась в выработке низкоаффинных антител, которые не смогли нейтрализовать вирус, но при этом увеличили тяжесть заболевания за счет создания очагов воспаления в легких.

Эта неудача полностью исключила возможность создания вакцины на основе разрушенного вируса. Оставалось возможным либо использование живого аттенуированного вируса, либо создание рекомбинантной вакцины на основе белковых субъединиц, изолированных от вирусной частицы. Хотя на разработку аттенуированного вируса было затрачено множество усилий, они так до сих пор и не смогли привести к созданию устойчивого иммунного ответа.

Непросто оказалось и создание рекомбинантной вакцины. Вирусный белок F, вызывающий иммунную реакцию, существует в двух формах. Его активная форма, называемая пре-фузионной конформацией, нестабильна и с трудом поддается очистке. Стабильная же пост-фузионная конформация менее иммуногенна, и вакцины, использующие стабильную форму антигена, не эффективны.

Во время своей работы в Центре исследований вакцин в Национальном институте аллергии и инфекционных заболеваний США, Джейсон Маклеллан (Jason McLellan) с коллегами разработали антиген F протеина, который был лицензирован Icosavax для использования в синтетических частицах. Исследователи смогли зафиксировать белок до слияния с антителами, таким образом, предотвратив его преобразование в пост-фузионную конформацию.

За счет этой фиксации стало возможным тщательное изучение атомной структуры белка путем рентгеновской кристаллографии, в результате чего был получен способ его модификации и стабилизации. Добавив дисульфидную связь и заполнив две гидрофобные полости, они успешно зафиксировали белок в активном состоянии. «Мы называем его «DS-Cav1» из-за мутаций дисульфидной связи (DS) и заполнения полостей (Cav1)», — говорит Маклеллан, который сейчас работает в Техасском университете в Остине. «Во время испытания мы получили титры антител, которые были в десять раз выше, чем при использовании пост-фузионной формы».

Антиген был лицензирован различными компаниями для разработки вакцин. Уникальный подход Icosavax сочетает в себе стабилизированный антиген с методикой создания самособирающихся наночастиц. Для оптимизации иммунной реакции, антиген связывают с вирусоподобной частицей (VLP) — пустой оболочкой без генетического материала. VLP имитирует симметричную и повторяющуюся структуру вирусного капсида, провоцируя таким образом реакцию иммунной системы.

«Реакция организма на вирус сильно отличается от его реакции на простой растворимый белок», — говорит Адам Симпсон, генеральный директор компании Icosavax. Некоторые вакцины, например вакцины против вируса папилломы человека и гепатита В, производятся с использованием вирусных структурных белков, которые естественным образом самособираются в VLP. «И это одни из самых эффективных вакцин, когда-либо выпущенных на рынок», — добавляет он.

К сожалению, было выявлено всего несколько естественно самособирающихся VLP, и они не всегда подходят к антигену, нужному для создания искомой вакцины. Способа масштабного производства синтетических VLP, несущих сложные антигены, не было до недавнего времени.

Кинг и его коллеги из IPD смогли получить различные конфигурации VLP, содержащие различное количество молекул антигена DS-Cav1, используя исключительно синтетические конструкции. Лучшей конфигурацией оказалась икосаэдрическая форма, аналогичная футбольному мячу и состоящая из двух субъединиц, на одной из которых закреплен антиген. Гениальность этой конструкции заключается в том, что обе субъединицы могут быть изготовлены по отдельности с использованием традиционной технологии рекомбинантных белков. При смешивании, субъединицы самостоятельно собираются в «футбольный мяч» VLP с 20 копиями антигенов, нанесенных на поверхность.

«Вы можете просто смешать их и в итоге получите сложную макромолекулярную структуру, которую иначе было бы невозможно изготовить», — говорит Симпсон. — «Иммунная реакция на такие наночастицы примерно в десять раз превысила реакцию на отдельный антиген, как у мышей, так и у приматов». В будущем самособирающиеся VLP могут быть перенастроены на отображение других вирусных антигенов в надежде сделать вакцины от других «неподатливых» болезней. Недавно Кинг и его коллеги использовали тот же подход для создания двухкомпонентной самособирающейся наночастицы, отображающей стабилизированные версии белка оболочки ВИЧ. Частицы стимулировали сильную иммунную реакцию у кроликов.

Станет ли эта вакцина практична для использования в наиболее страдающих от RSV странах третьего мира, в значительной степени будет зависеть от производственных затрат. Джанронг Ли (Jianrong Li) из Университета штата Огайо полагает, что живой аттенуированный вирус можно выращивать гораздо дешевле. «После того, как у вас появилась одобренная линия клеток, вырастить вирус не проблема», — заявляет он. Вакцина на основе живого аттенуированного вируса еще не является жизнеспособным продуктом. Но если работа Ли ознаменуется успехом, его подход может создать конкуренцию синтетической вакцине, поскольку стоимость производства и очистки синтетических наночастиц нельзя недооценивать.

Однако использование синтетических самособирающихся наночастиц может позволить разработчикам вакцин гораздо лучше контролировать конечный продукт, говорит Даррелл Ирвин (Darrell Irvine) который работает над иммунологическими наночастицами в Массачусетском технологическом институте. «Их технология предоставляет захватывающую возможнось изучать такие переменные, как размер частиц и оптимальную плотность антигена», — говорит он. — «В то время как сотрудники Icosavax могут создавать частицы оптимального размера и с оптимальным расположение антигена, использование существующих вирусных платформ ограничено их естественными параметрами».

Для разработки синтетических вакцин на основе наночастиц, в 2019 году, во время инвестиционного раунда А, компания Icosavax привлекла $51 млн. таких инвесторов как, Qiming Venture Partners USA, Adams Street Partners, Sanofi Ventures и NanoDimension. «Нам необходимы невероятные технологии, но они недостаточны», — отмечает Симпсон. — Защита от RSV является важной нерешенной медицинской задачей, и сочетание технологии самосборки с антигеном делают разработку вакцины против этого заболевания идеальным стартом для компании. У нас в руках действительно отличная технология в сочетании и действительно сильной командой, обладающей огромным опытом в разработке и производстве вакцин».

«Мы очень тщательно продумываем каждый наш шаг, потому, что успех предприятия необычайно важен», — говорит Кинг. — Когда мы проанализировали первые данные исследования вакцины RSV на приматах, то увидели то же усиление иммунного ответа, которое уже наблюдали у мышей. Вот тогда мы и решили, что наша технология уже достаточно зрела».

На данный момент компания Icosavax расширяет масштабы своей работы над вакциной RSV, стремясь начать ее испытания в 2021 году.

Донорских тромбоцитов постоянно не хватает, они имеют короткий срок хранения и подвержены заражениям. Компания по производству стволовых клеток Platelet BioGenesis ставит своей задачей производить тромбоциты из iPSC. Рынок для лечения тромбоцитопении, включая лечение рака, а также травм и других неотложных потребностей, просто огромен. Некогда аспирант в лаборатории Даны Девайн, занимавшийся в конце 2000-х решением проблем с поставками, а сейчас главный врача Канадской службы крови Джонатан Тон (Jonathan Thon), обнаружил, что есть пределы для улучшения донорский тромбоцитов. «Проблемы, с которыми мы сталкиваемся во время переливания крови, не могут быть решены небольшим продлением срока жизни тромбоцитов, — говорит Тон. — Нам принципиально необходимо отделить продукт от исходного материала [человеческой крови]. А в идеале самим производить отдельные тромбоциты».

Тон начал работать над решением этой проблемы в качестве постдока в гарвардской лаборатории Джо Италиано, эксперта по мегакариоцитам и биологии тромбоцитов. Мегакариоциты, находящиеся в костном мозге, вырастают до огромных размеров. Путем сложноорганизованного процесса от них отделяются тромбоциты, представляющие собой фрагменты их цитоплазмы. В лаборатории Италиано, а затем и в собственной лаборатории в Гарварде, Тон разработал способ имитации этого процесса — биореактор тромбоцитов. В качестве исходного материала для производства тромбоцитов служат iPSCs, которые легко дифференцируются в мегакариоциты и в то же время могут быть защищены от бактериального и вирусного заражения. В 2014 году, совместно экспертом по микрофлюидике Линасом Мазутисом (Linas Mazutis) и венчурным инвестором Свеном Карлссоном, Тон основал первую компанию по производству тромбоцитов из iPSC Platelet BioGenesis.

В течение первых 5 лет своего существования, вплоть до получения инвестиций на $26 млн. в сентябре прошлого года, компания весьма скромно финансировалась. «Мы основали эту компанию на наши собственные деньги, — говорит Тон. — Первая пара тысяч долларов была вложена мной и другими соучредителями». В основном поддерживаемая за счет частных инвесторов и государственных грантов, компания Platelet BioGenesis использовала первые годы деятельности для адаптации своего биореактора под нужды промышленного производства. В 2017 году Тон оставил свой пост в Гарварде и посвятил себя компании полностью в роли CEO и CSO.

Производство тромбоцитов можно рассматривать в качестве хорошего теста на инжиниринг стволовых клеток. Они не имеют ядра и полностью дифференцированы, что практически исключает риска развития онкологии, их можно безопасно облучать, чтобы удалить случайные ядерные клетки. Тромбоциты недолговечны и минимально иммуногенные, исходя из чего, аллогенные тромбоциты, как правило, безопасны. «К тому же и сам исходный продукт критически необходим в медицине», — говорит Тон.

Platelet BioGenesis создает целую производственную цепочку, от стволовых клеток до готовых к использованию тромбоцитов. «Начнем с того, что в нашем распоряжении имеется GMP-совместимая линейка iPSC клеток», — говорит Тон. Для дифференциации в мегакариоциты, компания переоборудовала лабораторный прототип в биореакторы промышленного масштаба, соответствующие требованиям надлежащей производственной практики (GMP). Мегакариоциты будут замораживаться и снова размораживаться в соответствии с потребностями биореакторов.

Тон и Мазутис спроектировали эти тромбоцитарные биореакторы на основе упрощенной имитации архитектуры костного мозга. Мегакариоциты подаются в пространство, похожее на костный мозг, из которого они проходят долгий и ветвистых через ряд щелей в соседний микрофлюидный канал, смоделированный по образцу кровеносных сосудов. Там мегакариоциты подвергаются деформационному воздействию, провоцирующему отшнуровку тромбоцитов.

До сих пор не удавалось наладить достаточное производство тромбоцитов, потому что в клеточной культуре вне организма мегакариоциты производят очень мало тромбоцитов. Для терапии же необходимо большое их количество, так одна стандартная доза, включает, по крайней мере, 300 миллиардов тромбоцитов. «Platelet Biogenesis имеет большой потенциал для лечения заболеваний, связанных с низким количества тромбоцитов», — говорит Эндрю Левитт (Andrew Leavitt), медицинский директор лаборатории костей и костного мозга для взрослых при Калифорнийском университете в Сан-Франциско. «Конечно, я надеюсь на их успех, но, в конце концов, все решат числа», — говорит он.

Один натуральный зрелый мегакариоцит способен производить 1000 и более тромбоцитов in vivo. Как показал Итальяно в ходе мартовского семинара, мегакариоциты, полученные из iPSC, могут производить до 20 тромбоцитов каждый, таким образом, на порядок превосходя мегакариоциты в стандартной клеточной культуре, но все же уступая естественным мегакариоцитам на два порядка.

Platelet BioGenesis компенсирует этот недостаток за счет массивного увеличения пропускной способности тромбоцитарных биорекаторов. Оригинальный биореактор имел один микрофлюидный канал. Согласно представленным Итальяно данным, его расширение до шестнадцати каналов, позволило произвести 14 миллионов тромбоцитов. В последствие, компания скомпоновала т.н. «лопасти» (blades) — 128-канальные устройства, состоящие из восьми 16-тиканальных биоректоров каждое. «Сейчас компания разрабатывает 40-лопастное устройство», — пишет Тон в электронном письме. Простая математика позволила довести количество производимых тромбоцитов до 4,5 миллиардов. При параллельной работе 60 устройств (или при меньшем количестве устройств, работающих последовательно в течение нескольких дней или недель) можно получить порядка 300 миллиардов тромбоцитов (точные данные компания отказалась предоставить). «Сейчас компания работает над производством тромбоцитов для первых клинических исследований на человеке, которые могут начаться уже в ближайшее время», — пишет Тон (более точные данные он отказался предоставить).

Первым делом Platelet BioGenesis должна продемонстрировать FDA, что тромбоциты, получаемые из стволовых клеток, не отличаются от обычных. «Цифры — ещё не всё, — говорит Левитт, — важны как количество, так и качество». В своем мартовском выступлении Итальяно сообщил, что тромбоциты, генерируемые биореакторами, несут на себе специфические для тромбоцитов маркеры, содержат характерные витки микротрубочек и также заполнены секреторными гранулами, характерными для тромбоцитов.

Особенно важно, чтобы искусственно изготовленные тромбоциты действительно выполняли нужные функции. Они также должны прилипать к стенке поврежденного кровеносного сосуда, таким образом, образовывая пробку, предотвращающую кровотечение. В двух исследованиях на мышах было показано, что тромбоциты Platelet BioGenesis действительно выполняют эти функции. В первом исследовании использовалась гуманизированная модель, при которой мышам были нанесены лазерные ранения, делающие возможной только работу человеческих тромбоцитов, блокируя собственные мышиные тромбоциты. «В экспериментальной группе, получившей тромбоциты Platelet BioGenesis, мы наблюдали первичный гемостаз и адгезию, — сообщает Итальяно, — в то время как собственные тромбоциты в контрольной группе (отрицательный контроль) не сработали». Во втором, более традиционном исследовании, введенные тромбоциты Platelet BioGenesis были маркированы красителем. На показанных Итальяно изображениях видно, как помеченные тромбоциты ремоделируют поврежденную ткань совместно с собственными тромбоцитами мыши.

Основным конкурентом Platelet BioGenesis является компания Megakaryon, отделившаяся в 2011 году от Киотского университета в Японии. Основатель Megakaryon Кодзи Это (Koji Eto) изобрел тромбоцитарный биореактор, похожий по концепции на биорекатор Platelet BioGenesis, но дополнительно использующий турбулентность для увеличения производства тромбоцитов. Кроме того, Megakaryon разработал бессмертные культуры клеток для производства исходного материала.

Даже если Platelet BioGenesis решит свои количественные проблемы, и их биорекаторы сравняются с продукцией Megakaryon, им еще придется конкурировать с донорскими тромбоцитами, а это отнюдь не является простой задачей, учитывая сложность и высокую стоимость производства Platelet BioGenesis. Этот процесс включает в себя сложносоставные биореакторы, необходимые реагенты, питательную среду, факторы роста и молекулы для дифференцировки стволовых клеток в мегакариоциты. Однако несмотря на то, что ценовой фактор является одной из главных основной движущей силой, Тон подчеркивает такие преимущества стволовых клеток, как безопасность и доступность.

При использовании донорских тромбоцитов всегда есть риск бактериального заражения, поскольку тромбоциты хранятся при комнатной температуре, и просто невозможно провести проверку на все существующие вирусы. В тоже время многие бедные страны вообще не имеют доступа к тромбоцитам. «В идеале мы должны найти способ производства тромбоцитов в промышленных биореакторах, таким образом, обезопасив их от заражения бактериями и вирусами, а затем сделать их доступными для трансфузий в любой точке мира», — говорит Тон.

В более долгосрочной перспективе Platelet BioGenesis работает над использованием тромбоцитов для доставки биологически-активных веществ в ходе терапевтических процедур. Тромбоциты содержат секреторные гранулы, несущие в себе ангиогенные факторы, которые теоретически могут быть заменены на некое терапевтически полезное вещество, например, на лекарства от рака. «Этой технологии можно будет найти множество применений и "об этом уже долго рассуждают в нашей сфере", — говорит Левитт, — однако, до практической реализации этой идеи еще очень и очень далеко».

Лимфатические узлы являются идеальной целью для противораковой вакцины потому, что именно там происходит активация клеток CD8+ T, необходимых для мощного противоопухолевого ответа. Когда Даррелл Ирвин (Darrell Irvine) — биомедицинский инженер Массачусетского технологического института узнал, что хирурги могут помечать метастазы в лимфатических узлах с помощью с мелкомолекулярного красителя, его осенила идея. Молекулы красителя плотно связываются с альбумином в интерстициальной жидкости на месте инъекции, а затем транспортируются вместе с ним в лимфатический узел. «Мы поняли, что эта же стратегия может быть использована для целевой транспортировки лекарственных препаратов, и в частности, вакцин, в лимфатические узлы», — говорит Ирвин.

Идея использования альбумина в качестве транспортного средства, привела Ирвина к основанию компании Elicio Therapeutics. Альбумин имеет несколько липидно-связывающих карманов. Для их использования группа Ирвина разработала молекулы, состоящие из диацетил-липидного хвоста, связанного с неким лекарственным средством (например, опухолевым антигеном для создания вакцины или лигандом для усиления ответа химерного антигена (CAR)-T) через прокладку полиэтиленгликолевого спейсера. Подобные «амфифильные вакцины» являются как гидрофильными (спейсер), так и липофильными (хвост).

Почему эти молекулы должны быть амфифильными? С одной стороны, она должна быть гидрофильной, чтобы обеспечить растворимость при транспортировке в лимфатический узел. И в то же время она должна быть липофильной для того, чтобы липидные хвосты (с молекулой транспортируемого вещества) отскакивали от альбумина, и затем встраивались в мембраны антигенпрезентирующих клеток (APC) в лимфоузле, таких как макрофаги и дендритные клетки. В том случае, если этот метод используются для транспортировки вакцины, клетки APC принимают от альбумина антиген, обрабатывают его и выставляют на молекулах MHC, таким образом давая Т-клеткам возможность распознать его и активизироваться. Критическим является момент введения вещества в мембрану. «По сути, таким образом, антиген либо лекарственное вещество сохраняется и накапливается в лимфатическом узле, — говорит Ирвин. «В то время как при проведении традиционной пептидной иммунизации антиген пропадает уже через несколько дней, в случае использования «амфифильной вакцины» он работает около 14 дней. Вероятно, именно этот факт имеет кардинальное влияние на силу Т-клеточного ответа».

В адаптивной клеточной терапии Elicio, в качестве полезной нагрузки выступают лиганды CAR-T, такие как vIII мутантный эпитоп эпидермального рецептора фактора роста. Elicio намеревается применять этот подход в основном против массивных опухолей, в которых применение CAR-T-клеток малоэффективно. Как и в случае с вакцинами, амфифифильная молекула связывается с альбумином и транспотрируется к лимфатическому узлу. После этого лиганд CAR-T связывается с мембранами APC. Клетки CAR-T, вводимые отдельно, поступают в лимфатические узлы и распознают эти лиганды, наряду со «всеми другими стимулирующими рецепторами и цитокинами, вырабатываемыми этой дендритной клеткой составе Т-клетки», — говорит Ирвин. После этого происходит деление, за счет чего увеличивается общее количество высоко функциональных Т-клеток. «Таким образом, транспотрированные из лимфоузла в опухоль CAR-T клетки могут лучше справляться с иммуноподавляющими свойствами среды», — добавляет Ирвин.

Компания Elicio начала свою деятельность в 2011 году под названием Vedantra Pharmaceuticals, целью которой являлась коммерциализация другой разработанной в лаборатории Ирвина технологии нацеленной на лимфатические узлы. Их крупнейшим и учредителем является компания Clal Biotechnology Industries, которая управляет биотехнологическими инвестициями британско-американского бизнесмена Лена Блаватника (Len Blavatnik). Около трех лет назад компания полностью перешла на амфифилтную технологию, а позже сменила название на Elicio. К марту 2019 года был завершен 6-миллионный инвестиционный раунд А, а через полгода — 40-миллионный раунд В.

Уже в этом году Elicio планирует начать клинические испытания вакцины рака поджелудочной железы и толстой кишки, основанной на действии мутантного антигена KRAS. За ней последует вакцина против рака головы и шеи с использованием антигенов вируса папилломы человека (HPV). Разработка CAR-T также стремительно развивается. «Мы активно общаемся с рядом потенциальных академических и коммерческих партнеров», — говорит Ирвин. — Я очень надеюсь, что уже через год или два мы сможем провести испытания на людях».

«Амфифильная вакцина Elicio очень многообещающа», — говорит директор Лаборатории инженерии биотомодулирующих материалов Университета Миссури Брет Улери (Bret Ulery). «Они смогли действительно добиться отличной иммунной реакции», — говорит он. Однако, и у конкурирующих подходов есть свои преимущества. Например, вакцины агрегирующие антигены внутри полимерной или металлической частицы, в липосоме или другом липидном комплексе, также будут поступать в лимфатические узлы, при условии что они стабильны и имеют правильный размер. BioNTech, например, уже проводят клинические испытания РНК-липоплекс вакцины от злокачественной меланомы. Использование частиц может оказаться более эффективными: «каждый раз, когда клетка усваивает наночастицу, — говорит Улери (Ulery) —, высвобождаются сотни или тысячи пептидных антигенов, в то время как амфифильная молекула Elicio доставляет только один пептид или белок. Таким образом, она должна перенести огромное количество полезного вещества, прежде чем будет вызван терапевтический эффект. При использовании вакцин из частиц, для достижения того же эффекта потребуется меньше взаимодействий».

Ирвин возражает, что получить достаточную дозу его амфифильной вакцины — не проблема. «Эти амфифилы настолько эффективно попадают в лимфатический узел, что они просто заполняют собой все», — говорит он. — Так что совершенно неважно, что транспортируется всего лишь одна молекула за раз. Мы помещаем тысячи молекул на каждый APC». Ирвин, который много работал с вакцинами из твердых частиц, утверждает еще не видел основанную на частицах вакцину, которая могла бы конкурировала с амфифильной технологией. По его словам, это может быть связано с тем, что частицы, как правило, уничножаются макрофагами или дендритными клетками, в то время как амфифилы сохраняются на поверхности клеток APC, менее подвержены уничтожению и более эффективно обрабатываются для презентации MHC.

Улери признает недостатки частиц, однако отмечает, что только клиническое тестирование может определить превосходство амфифильных вакцин. «Я не думаю, что лучшее решение этой проблемы уже найдено», — говорит он. Наиболее серьезной проблемой, касающейся любой вакцины против рака, является уммуносупрессивное действие опухоли. «Амфифилы Elicio могут оказаться неэффективными. Например, вы можете вызвать некоторую иммунную реакцию, в ответ на которую раковые клетки адаптируются и прекращают экспрессию целевого антигена. Или в случае твердой опухоли, доставка активных цитотоксичных Т-клеток может оказаться затрудненной».

Ирвин знает об имеющихся препятствиях, но он воодушевлена тем, что амфифильная вакцина (в отличие от практически любых других вакцин против рака), уже показала свою эффективность в доклинических испытаниях на животных. В работе, опубликованной в 2014 году, его группа протестировала вакцину на двух различных типах опухолей у мышей: Опухоли TC-1, экспрессирующей онкопротеин ВПЧ E7, и опухоль меланомы B16F10. В обоих случаях амфифильные вакцины показали свое превосходство над растворимыми вакцинами без амфифильного каркаса.

Усилитель CAR-T от Elicio сталкивается с меньшим количеством препятствий, чем вакцины, потому что мощные противоопухолевые Т-клетки уже присутствуют в кровообращение. В доклинических исследованиях Ирвин наблюдал распространение антигена по опухоли, в то время как CAR-T клетки вызвали противоопухолевую иммунную реакцию. Ирвин полагает, работа CAR-T-клеток способствуют распространению антигена, что является ключом к успеху любой иммунотерапии при раке.

Однако остаются открытыми два вопроса. Во-первых, уничтожат ли клетки CAR-T, клетки APC презентующие лиганд CAR-T в лимфатическом узле, а во-вторых, не вызовет ли дополнительная стимуляция CAR-T побочных аутоиммунных эффектов. В своих экспериментах Ирвин не наблюдал ни того, ни другого. «Возможно, что дендритные клетки в лимфатическом узле имеют какие-то средства защиты», — говорит он. — Мы все еще работаем над тем, чтобы понять этот механизм». Однако Elicio сталкивается с потенциальной конкуренцией со стороны усилителя CAR-T от BioNTech – одного из многих новых подходов к улучшению CAR-T клеточной терапии.

До недавнего времени сбор средства для Elicio был затруднен, поскольку десятилетия неудачных попыток и лишили идею разработки противораковой вакцины привлекательности для инвесторов», — говорит генеральный директор Боб Коннелли (Bob Connelly). «Общаясь с потенциальными инвесторами, я не раз слышал: «О, на вакцинах от рака мы уже обожглись», — говорит он, — после проектов KRAS и ВПЧ, мы больше не разрабатывает вакцин. Вместо этого, мы продвигаем клеточную терапию с использованием амфифильной технологии. Инвесторы гораздо охотнее принимают участие в ранних разработках клеточной терапии, поскольку, в отличие от вакцин от рака, это определение несет в себе негативной коннотации».

Теперь компания должна показать, что ее вакцины и/или усилитель CAR-T работают на людях. В этом случае будут разрабатываться новые применения для клеточной терапии. «Использование лимфатических узлов, — говорит Коннелли, — играет центральную роль в любой клеточной или иммунотерапии, действительно зависящей от иммунного ответа».

Объединившись с четырьмя тяжеловесами из Гарвардской медицинской школы — Джорджем Дейли, Ричардом Грегори, Петром Слизом и Фрэнком Слэком (George Daley, Richard Gregory, Piotr Sliz, and Frank Slack) — для воплощения этой идеи в жизнь, компания получила огромное финансирование в 82,8 в результате инвестиционного раунда А.

Предприятие просуществовало более десяти лет. Все началось в 2006 году в лаборатории Джорджа Дейли (George Daley), когда Студент Сринивас Вишванатан (Srinivas Viswanathan) получил доказательства того, что семейство микроРНК let-7, которые являются супрессорами опухолей, регулируется в процессе развития. Примерно в это же время Ричард Грегори (Richard Gregory), специалист по биохимии обработки микроРНК, был принят на работу в Гарвардский медицинский институт. С его помощью было обнаружили, что регулируемый в процессе развития белок Lin28 блокирует обработку let-7 микроРНК в эмбриональных стволовых клетках. Поскольку let-7 является супрессором опухолей, это означало, что Lin28, как отрицательный регулятор супрессора опухолей, сам является онкогеном, предположил Дэйли.

В 2011 году Петр Слиз (Piotr Sliz) и его коллеги описали кокристаллическую структуру let-7 и Lin28, сделав таким образом возможным воздействие на этот комплекс. Они начали разрабатывать пути поиска молекул, противодействующих взаимодействию между Lin28 и let-7, и таким образом, потенциально обладающих противораковыми свойствами. Команда была полностью сформирована с приходом в нее специалиста по РНК Фрэнка Слэка (Frank Slack).

В процессе поиска финансирование для проекта, исследователи поняли, что могут получить внешнее финансирование для создания компании. На самом деле Дейли, у которого были давние отношения с MPM Capital, высказывал эту идею еще десять лет назад. Так в проект попала Сиосаки, директор MPM Capital, знакомая с Дейли со времен запуска Epizyme в 2007 году. Сиосаки была покорена перспективой решения проблемы дисрегуляции РНК с помощью малых молекул. «Большая часть РНК ассоциируется с белком; именно здесь открытие Джорджем Дэйли протеина Lin28, регулирующий образование зрелого let-7, сыграло ключевую роль. Именно связь этого белка и РНК заставила нас задуматься», - говорит она. «Может ли небольшая молекула, ингибирующая эту ассоциацию между Lin28 и let7, позволить предшественнику let-7 пойти по другому пути развития?», — задается она вопросом. Если это так, то такая молекула может обладать мощными противоопухолевыми свойствами.

Несмотря на то, что Сиосаки не сообщила никаких подробностей, она подтвердила выявление молекул, работающих с комплексом Lin28 - let-7. В этом подходе она видит и потенциальное решение других воспалительных или фиброзных расстройств, связанных с дисрегуляция тех же компонентов. Кроме всего прочего, компания ведет поиски других протеинов, связывающих РНК, на которые могут быть нацелены малые молекулы. «Мы пока не предоставляем публичной информации, тем не менее, мы действительно выявили и другие интересные РНК-связывающие белки», — говорит Сиосаки.

Виджай Санкаран из Гарвардского института стволовых клеток работает над тем, чтобы использовать Lin28 в гематологии. Он обнаружил, что Lin28 участвует в процессе превращения фетального гемоглобина в зрелый. Контроль над этим процессом мог бы помочь в лечения различных расстройств. Однако тут есть одно но: поскольку Lin28 обладает плеотропными свойствами, в некоторых условиях его использование может привести к нежелательным последствиям. Несмотря на это, он с большим энтузиазмом воспринимает возможность вмешательства во взаимодействие белка с РНК в таких процессах, как трансляция, и очень надеется, что это поможет его пациентам.

Сиосаки любит руководить многообещающими компаниями — сбор всех частей паззла для получения финансирования, наем первых сотрудников, поиск места, получение первых результатов и первый запуск. Дейли очень доволен своим партнером. «С Кадзуми я бы мог начать любое дело». Она очень интеллигентный и грамотный медик-химик, обученный в области органической химии. А кроме того у нее просто удивительная предпринимательская хватка», — говорит он.

Как декан Гарвардской медицинской школы, Дэйли был разочарован тем, как трудно развивать терапевтическое лечение в академических кругах, поэтому он создает программы, чтобы заполнить некоторые пробелы. «Если бы этот проект не был замечен MPM и Astellas, я думаю, о нем просто забыли бы», — говорит он.

В последнее время редактирование РНК начинает вызвать больший интерес, чем редактирования ДНК и открытия двадцатилетней давности занимают свои места на столах инвесторов. Еще в 1995 году Тод Вульф, Дженнифер Чейз и Дэн Стинчкомб (Tod Woolf, Jennifer Chase, Dan Stinchcomb) впервые продемонстрировали способ редактирования РНК при помощи олигонуклеотидов. Вскоре после этого Джош Розенталь (Josh Rosenthal), работавший в то время в Стэнфорде, обнаружил, что головоногие могут рекодировать РНК своих нейронов. Значение этих открытий для терапии человека в то время не было очевидно - месяцы работы Розенталя ушли на клонирование всего одной последовательности, что кажется просто невообразимым на сегодняшний день.

В прошлом году появились компании Beam Therapeutics и Locana с планами базового редактирования ДНК и РНК на основе CRISPR. В этом году две другие компании, Shape Therapeutics и Korro Bio начали использовать аденозиндеаминазу (ADAR) — другой фермент, модифицирующий РНК, эндогенный и широко распространенный в клетках человека. Редактирование РНК с помощью ADAR имеет ряд преимуществ перед некоторыми способами редактирования ДНК, например, человеческий фермент не вызывает иммунного отторжения, которое может быть спровоцировано CRISPR, использующим бактериальные эндонуклеазы.

Фермент ADAR преобразует аденозин в инозин, который при переводе считывается как гуанозин, в сущности, преобразуя A в G. Во время работы над клонированием генов ионных каналов из кДНК гигантских аксонов кальмаров, Розенталь обнаружил, что головоногие склонны использовать этот эффект в своей нервной системе. Он никак не мог получить идентичные клоны одной последовательности и, при более внимательном анализе, обнаружил вариации G-A в определенных ее точках. «Они перекодируются как сумасшедшие», — говорит Розенталь. Позже Розенталь создал свою собственную лабораторию в Институте нейробиологии Медицинского факультета Университета Пуэрто-Рико и при поддержке студента приступил к реализации проекта по коррекции мутации муковисцидоза с использованием ADAR, в котором был установлен линкер белка λ-фаги, присоединяющий антисенсорный олиго к каталитическому (деаминазному) домену. Они нацелили олиго на кодон преждевременной остановки в мутировавшем гене регулятора трансмембранной проводимости при муковисцидозе (CFTR) и протестировали эту конструкцию на яйцеклетках Xenopus. Несмотря на новаторский аспект работы, она был в значительной степени проигнорирован.

Розенталь продолжил работу по перекодированию РНК головоногих посредством ADAR, используя новые поколения спроектированных ферментов. Его подход к экзогенному поступлению фермента позволит ему редактировать РНК в клетках или тканях с низким его уровнем. Он также надеется расширить спектр возможных мишеней; фермент требует наличия определенных нуклеотидов, которые окружают «А» в нужном месте последовательности. Розенталь считает, что он может преодолеть некоторые из этих ограничений путем обработки фермента.

Через какое-то время, Розенталь перевел свою лабораторию в Морскую биологическую лабораторию Чикагского университета в Вудс-Холе, штат Массачусетс. Год спустя он продемонстрировал свою работу группе инвесторов в Кембридже, на которой присутствовал и Нессан Бермингем (Nessan Bermingham), бывший генеральный директор компании Intellia Therapeutics, занимающейся редактированием ДНК на основе CRISPR. В настоящее время Бермингем является исполнительным председателем компании Korro Bio, которая лицензировала систему Розенталя. «CRSPR существует уже достаточно давно и со временем стали видны ее ограничения. Стало понятно, что редактирование РНК может быть очень мощным местом для вмешательства», — говорит Розенталь.

Бермингем, который совсем недавно освободился от обязанностей генерального директора Intellia, пока не планировал приобретать новую компанию, но, как член Atlas Venture, принял участие в стартовом финансировании проекта RNA-редактирования. После того, как он увидел, что таким образом можно нацеливаться на специфические остатки «А» и что ADAR может быть использован in vivo — он согласился на запуск новой компании.

Руководство компании Korro не раскрыло, какими заболеваниями они планируют заниматься, однако Бермингем сосредоточен на упрощении доставки и синтеза олигонуклеотидов. В идеале он хотел бы использовать эндогенную систему редактирования РНК, при условии ее достаточной эффективности, чтобы избежать постоянных редакций ДНК, долгосрочные последствия которых неизвестны. «В первую очередь мы думаем о безопасности пациентов, затем проверяем правильность выбора цели, и только потом переходим к более постоянным модификациям», — говорит он. По словам Бермингема компания в первую очередь сосредоточится на редактировании мутаций G-А-G при генетических заболеваниях. Более дальней целью можно считать создание защитных мутаций или редактирование сайтов пост-трансляционной модификации для модуляции специфических функции белка.

Shape Therapeutics была сформирована Прашантом Мали и Франсуа Виньо (Prashant Mali, Francois Vigneault), которые подружились в лаборатории Джорджа Черча (George Church) еще в начале 2010-х годов.

О своем друге и компаньоне Виньо говорит следующее: «Прашант сделал нечто совершенно уникальное — он использовал код РНК, чтобы подобрать эндогенный АДАР, и таким образом, сделал возможным терапевтическое лечение. Он единственный, кто показал действенность этого концепта in vivo». Мали провел два эксперимента по редактированию РНК у мышей страдавших от мышечной дистрофии Дюшенна и дефицита транскарбамилазы орнитина. Он смог восстановить экспрессию гена для дистрофина, перекодируя мутацию, которая привела к преждевременному прекращению трансляции. По словам Виньо, эта работа и послужила толчком для запуска компании.

Shape Therapeutics работает на трех фронтах. Первый - это проектирование полезной нагрузки РНК и оптимизация вторичной структуры для максимизации набора ADAR. Второй - метод доставки, основанный на новой системе адено-ассоциированных вирусов (AAV)-5, которые вызывают меньший иммунный ответ по сравнению с другими видами AAV. Компания создала библиотеку состоящую из 1011 AAV, которая будет протестирована на приматах. Третьим является налаживание производства, путем оптимизации использования уже существующих платформ. Компания также лицензировала спроектированную тРНК, которая заменяет бессмысленную мутацию, и являет собой альтернативный подход к целенаправленной работе с конкретными мРНК.

Редактирование РНК переживает раннюю пору своего становления, однако их ценность уже не вызывает сомнения. «До недавнего времени наши исследования не воспринимались всерьез; у нас даже не было собственных исследовательских секций в NIH», — говорит Розенталь. Впервые биотехнологии были представлены на прошлогодней конференции Гордона по редактированию РНК (Gordon Conference on RNA editing).