Внеклеточные везикулы.
Когда золотник дорог.
Часть 1: что это?

Мембранные пузырьки, высвобождаемые эволюционно консервативным способом большинством живых клеток организмов (от бактерий до млекопитающих).

То есть в процессе эволюции везикулы и процесс их высвобождения сохранился у всех живых организмов.

Первоначальное видовое обилие ВВ (аргосома, кардиосома, детеросома, эктосома, онкосома, себосома) сегодня среди исследователей принято сводить до 3 видов: экзосомы, микровезикулы и апоптотические тельца.

В последнее время ВВ отводят большую роль в процессах межорганной коммуникации с целью поддержания метаболического гомеостаза. Для регуляции метаболизма на уровне организма необходимо взаимодействие мозга, поджелудочной железы, печени, мышц и жировой ткани (рис.5).

Адипоциты «замечены» в процессе выделения экзосомоподобных ВВ, которые могут взаимодействовать с фибробластами, преадипоцитами, эндотелиальными и иммунными клетками, координируя ответ ткани на различную доступность топлива. Эти сигналы играют существенную роль в становлении инсулинорезистентности (ИР) и ожирения.

ВВ из адипоцитов мышей с ожирением запускают активацию макрофагов и ИР. В то же время, экзосомы, полученные из стволовых клеток жировой ткани, улучшают чувствительность к инсулину и приводят к снижению веса у мышей с ожирением. А ВВ из крупных, наполненных жиром, адипоцитов могут стимулировать синтез липидов у мелких адипоцитов в культуре клеток (Samuelson I., 2018).

«Молекулярные посылки», отправляемые старыми (сенесцентными) клетками, оказывают существенное влияние на организм (рис.6). Сенесцентные клетки выделяют больше ВВ, чем молодые, что приводит к провоспалительному сигналу. В то же время, с возрастом в плазме крови наблюдается снижение концентрации ВВ (в период с 30 до 70 лет), что может быть вызвано истощением пула стволовых клеток. Получается, что сигналы «старых» клеток растут, а «молодых» — падают.

При этом, при старении клеток происходит изменение состава ВВ, как РНК, так и белкового. У пожилых снижается количество галектина-3, который участвует в созревании остеобластов, что является одной из причин снижения образования костей с возрастом. Крупные EV, изолированные из плазмы пожилых или сенесцентных эндотелиальных клеток, приводили к кальцификации клеток гладких мышц аорты (Takasugi M., 2018).

«Лидерами» в производстве экзосом считаются стволовые клетки.

Начиная с 2010 года пристальное внимание исследователей привлекают экзосомы мезенхимальных стволовых клеток (MSCs). Дело это не такое простое, так как изучение культивируемого MSCs белкового состава показывает большое разнообразие и количество белков: в среднем, около 400. При этом, около 150 из них — общие для разных партий культивируемых MSCs.

Видимо, они оказывают комплексное воздействие на организм, эффект от которого сравним с использованием самих стволовых клеток.

Но при этом у экзосом более высокий профиль безопасности. На моделях грызунов изучали возможность использования экзосом при повреждении почек, печени, сердечной недостаточности и для регенерации скелетных мышц. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки и образованные из них MSC (iMSCs), судя по всему, превосходят мезенхимальные по количеству производимых экзосом и также активно изучаются с целью терапевтического воздействия (Yanning Liu, 2017).

Одним из примеров сложной в высшей степени сигнализации с участием ВВ является нервная система (НС). Она требует особенно высокого уровня интерактивного обмена между сенсорными и моторными нейронами, интернейронами и глией.

Показано, что при деполяризации кортикальные нейроны высвобождают ВВ, содержащие различные белки (молекула клеточной адгезии L1 (L1CAM), Glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins (GPI-APs) и glutamate receptor subunit GluR2/3), регулируя таким образом синоптическую активность.

Недавно было обнаружена роль ВВ в нервном развитии через миРНК-несущие ВВ в эмбриональной спинномозговой жидкости (eCSF) как грызунов, так и людей. Добавление eCSF-производных ВВ к нервным стволовым клеткам активировало путь mTORC1, увеличивая скорость пролиферации этих стволовых клеток.

Также известно, что нейроны утилизируют рецепторы нейромедиаторов и миРНК посредством ВВ для регулирования их возбудимости. ВВ выпускаются практически из всех типов клеток в мозге, включая нейральные стволовые/прогениторные клетки, нейроны, астроциты, олигодендроциты и микроглии, а также шванновские клетки и нейроны периферической НС (Breakefield X.O., 2016).

ВВ-сигнализация имеет особое значение в регуляции физиологической функции ЦНС, и астроциты, микроглия, олигодендроциты и нейроны общаются друг с другом через секрецию ВВ. И эта коммуникация на основе ВВ может простираться за пределы ЦНС.

Результаты последних исследований показывают, что при воспалении ВВ, полученные из нервных стволовых клеток, индуцируют активацию провоспалительных цитокинов, сигнальных молекул в иммунных клетках (Indiveri C., 2019). Что показывает потенциальную роль для ВВ-опосредованных перекрестных связей между ЦНС и иммунной системой за пределами гематоэнцефалического барьера.

Кстати, ВВ — первый способ, которым можно ответить «нет» поклонникам. Именно так и поступает яйцеклетка после оплодотворения, выделяя в своих ВВ рецепторы к сперматозоидам и предотвращая таким образом полиспермию.

ВВ в семенной жидкости играют важную роль в оплодотворении, защищая сперматозоиды в женских половых путях и регулируя их подвижность и созревание.

Многочисленные функции ВВ в физиологии спермы основаны на способности переносить молекулы либо в сперматозоиды, либо в иммунные клетки женского репродуктивного тракта. Сперматозоиды вступают в контакт с несколькими типами ВВ, которые могут затем способствовать оплодотворяющей способности, изменяя молекулярный состав и поведение. Сперматозоиды вступают в контакт с простасомами.

Было высказано предположение, что простасомы играют роль в регуляции конденсирования и экзоцитоза акросом. Это сложная серия биохимических и биофизических изменений, которые сперматозоиды претерпевают в треке женских половых органов, чтобы приобрести свойства для оплодотворения и достичь ооцита (Yáñez-Mó M., 2015).

Матричная, или информационная, или белок-кодирующая, РНК (мРНК, mRNA) является матрицей для синтеза аминокислотной белковой последовательности, из которой потом образуется тот или иной белок. На нее «переписывается» информация с ДНК в ядре клетки, а потом мРНК отправляется в цитоплазму к рибосомам, где и происходит сборка будущего белка.

Если такую матрицу «упаковать» в экзосому и отправить клетке-адресату, то в ней может синтезироваться белок даже не характерный для данного типа клеток.

Интересно, что изучение ряда клеток опухолей показало, что определенная доля мРНК идет только «на экспорт», т.е. обнаруживается только в ВВ, выделяемых данной клеткой, но не обнаруживается в самой клетке.

Таким образом, экзосомальная мРНК является функциональной и может переходить в процесс трансляции к таргетной клетке, непосредственным образом влияя на производство белка в клетке-мишени.

В исследовании Ratajczak, опубликованном в 2006 году, автор выделил везикулы из культивированных стволовых клеток и обнаружил, что эти везикулы содержат РНК (Ratajczak, 2006), которая может быть доставлена к другим типам клеток (например, гемопоэтические клетки-предшественники).

Этот перенос молекулярной информации побуждал клетки-реципиенты вырабатывать маркерные белки, характерные для плюрипотентных, эволюционно гибких стволовых клеток, из которых возникли везикулы.

Это открытие имело важное значение для регенеративной медицины. Внеклеточные везикулы из стволовых клеток, в том числе и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, могут быть использованы для прямого восстановления поврежденной ткани. Более того, такой подход позволил бы избежать необходимости введения пациентам потенциально иммуногенных клеток.

По мнению ученых, используя везикулы, полученные из стволовых клеток, возможно было бы проводить терапию стволовыми клетками без этих клеток. Как показали исследования, внеклеточные везикулы несут РНК с регенеративным потенциалом. Везикулы, полученные из эндотелиальных клеток-предшественников, вызывали прорастание новых капиллярообразных кровеносных сосудов (Karen Hopkin, 2016).

МикроРНК(miRNA) — это маленькие некодирующие однонитевые РНК (по ним нельзя собрать белок). Они не кодируют белки сами, но широко известна их способность влиять на экспрессию генов: микроРНК могут влиять на синтез белка, ингибируя трансляцию мРНК. То есть прибыв в клетку-мишень, посылка с микроРНК может коренным образом изменить ее работу.

«Упаковка» микроРНК в везикулы защищает ее от нуклеаз на пути до таргетной клетки. Интересно, что микроРНК может упаковываться в везикулы сразу с белками, необходимыми для ее процессинга или работы (Samuelson I., 2018).

Большую роль играет транспорт микроРНК с экзосомами в становлении и метастазировании опухолевых процессов.

Последние годы активно изучается роль экзосомальной микроРНК в нейродегенеративных заболеваниях (мозг содержит 70% известных микроРНК), мышечной саркопении и дегенерации сетчатки (Kim K.M., 2017).

Длинная некодирующая РНК (днкРНК, lncRNA). Этот класс РНК был открыт около 30 лет назад, но только последние годы начала проясняться их роль в жизни клетки. Они участвуют в контроле организации хроматина, транскрипции генов, трансляции белков, сборке макромолекулярных суперкомплексов.

Данный тип РНК изучали в ВВ клеток опухоли. Вероятно, она работает «в связке» с микроРНК. Служат ли везикулы с днкРНК своеобразной «губкой», которая потом «ловит» везикулы с микроРНК, либо же они способствуют загрузке микроРНК в экзосомы, до конца не ясно.

Кольцевые РНК (circRNA) относятся к некодирующим РНК, обнаруживаются в эукариотических клетках, образуются при помощи альтернативного сплайсинга и являются достаточно долгоживущими (у них нет концов, которые могли бы расщепиться эндонуклеазами).

Перенос ДНК при помощи ВВ изучен гораздо в меньшей степени, чем различных видов РНК. Тем не менее, ВВ могут переносить ДНК как в виде небольших ее фрагментов (около 100 п.о.), так и внушительных размеров цепи (несколько миллионов п.о.). При чем большая часть ДНК, переносимая ВВ, связана с их внешней мембраной, а не упакована внутрь пузырька, как это происходит с другими молекулами.

Внеклеточные функции РНК данного типа еще не до конца изучены, вероятно, они выполняют регуляторную роль.

Недавно было показано наличие и стабильность кольцевых РНК в везикулах, выделяемых раковыми клетками, что позволяет их использовать в качестве потенциального чувствительного и специфичного биомаркера для ранней диагностики (Daniele Fanale, 2018).

Роль переноса ДНК от клетки к клетке еще не до конца изучена. Недавнее исследование показало, что поверхностно-связанная ВВ-ДНК играет важную роль в связывании ВВ с фибронектином, (Nemeth A., 2017) гликопротеином внеклеточного матрикса, который имеет жизненно важное значение в процессах, связанных с прогрессированием опухоли (Wang J.P., 2017).

Единого мнения касательно того, может ли ДНК, доставленная с ВВ, функционировать в клетке-реципиенте, еще нет. Показано, что некоторые фрагменты ДНК, связанные с ВВ, содержат целые гены с промоторной и терминаторной областями (Gezsi A., 2019; Sukhvinder G., 2019). Эксперименты на модельном растении Arabidopsis thaliana показали, что ДНК, транспортируемая при помощи ВВ, может интегрироваться в геном клетки-реципиента, что подтверждает идею о горизонтальном трансфере ДНК при помощи ВВ (Stefanie Fischer, 2016).

Помимо двуцепопчечной ДНК в ВВ могут переноситься и другие ее типы, например, митохондриальная ДНК (мтДНК). В частности, исследуется роль переноса в онкологии молочной железы и других типах рака (Sansone P., 2017). МтДНК в микроокружении опухоли могут приводить к активации нейтрофилов и неблагоприятным прогнозам овариального рака (Singel K.L., 2018).

Помимо этого, концентрация внеклеточной мтДНК является важным маркером хронического воспаления, сопровождающего старение и нейродегенеративные заболевания.

Одним из путей выделения мтДНК в межклеточное пространство является ее упаковка в экзосомы (Anna Picca, 2018). При этом увеличение количества внеклеточной мтДНК сопровождает не только связанное с возрастом хроническое воспаление в мозге, но и, вероятно, вносит вклад в патогенез аутизма. Так, было показано, что в сыворотке крови детей с аутизмом было большое количество ВВ с мтДНК, провоцирующей воспалительные процессы через активацию микроглии (Irene Tsilioni, 2018).