- Генетическая инженерия и клонирование в бактериях
Клонирование генов и регуляторных последовательностей в плазмидных векторах, создание и реорганизация плазмидных конструкций, хромосомное (геномное) конструирование: введение генетически маркированных экспрессионных кассет Cre-loxР, flp-FRT, с целевыми генами в нужное вместо в геноме с помощью attP-attB сайт-специфической рекомбинации, с последующим удалением маркера, изменение регуляторных последовательностей ДНК непосредственно в хромосоме (при помощи lambda-Red технологии),
удаление генов и изменение необходимых последовательностей ДНК хромосомы хромосоме (при помощи lambda-Red технологии).
Манипуляции необходимые при клонировании: рестрикция фрагментов ДНК, очистка фрагментов ДНК из агарозного геля и ПЦР-смеси, лигирование фрагментов ДНК при помощи ДНК лизазы фага T4, безлигазное клонирование (In-fusion технология), перекрывающийся ПЦР, направленный мутагенез, приготовление электрокомпетентных и химически-компетентных клеток, электропорация и трансформация бактерий, фаговая трансдукция участков хромосом при помощи фагов P1, T4.
Работа с нуклеиновыми кислотами
Выделение геномной и плазмидной ДНК (колоночный метод, осаждение спиртом, очистка на шариках AMPure),.выделение тотальной РНК и мРНК (колоночный метод, гуанидинтиоционат/фенольный метод), измерение содержания нуклеиновых кислот на спектрофотометре, флуориментре Qbit, ПЦР, обратная транскрипция с последующим ПЦР в реальном времени, определение старта транскрипции методами удлинения праймера и клонирования 5’ конца, секвенирование ДНК (ПЦР-продукт и плазмида) по Сэнгеру (на оборудовании Applied Biosystems), анализ хроматограмм после секвенирования, электрофорез ДНК и РНК в агарозных и акриламидных гелях, получение меченных ДНК и РНК зондов, нозерн-блоттинг, саузерн-блоттинг, EMSA-анализ, 3С анализ (приготовление библиотек 3С и анализ взаимодействий между участками ДНК при помощи ПЦР в реальном времени).
Работа с белками и биохимия
Иммунизация кроликов, мышей и крыс, очистка высокоаффинных поликлональных антител, иммунопреципитация белков, приготовление тотальных и фракционированных лизатов клеток прокариот и эукариот, определение концентрации белка методами Брэдфорд и BCA, денатурирующий электрофорез в ДСН-ПААГ с последующей окраской Кумасси или вестерн-блоттингом, иммунопреципитация (IP), двумерный (2D) электрофорез (изофокусировка: амфолины и стрипы, на оборудовании BioRad), подготовка образцов для масс-спектрометрии, ингибиторный анализ, определение скорости дыхания митохондрий на оксиграфе, определение активности ферментов: β-галактозидазы, дегидрогеназ, фосфатаз, цитратсинтазы; газовая хроматография.
Работа с животными
Мыши C57BL/6, лабораторные белые крысы и мыши. Постановка датированной беременности для получения MEF, получение перитонеальных макрофагов и макрофагов костного мозга. Вскрытие мышей для получения эритроцитов и лимфоцитов из крови. Анализ массы органов.
Работа с культурами клеток человека и мыши
Ведение культур клеток человека и мыши: MT4, Huh-7, HeLа, HCT116, SCOV-3, Caov-4, HEK293T, U2OS клетки, MEF, перитонеальные макрофаги и макрофаги костного мозга; трансфекция эукариотических клеток при помощи СaP/Lipofectaminе/FuGENE, создание стабильных клеточных линий модифицированных лентивирусами несущими клонированный ген или shРНК.
Микроскопия и проточная цитофлуорометрия
Иммуноцитохимия с последующей конфокальной (Carl Zeiss LSM710, имею сертификат) и обычной флюоресцентной микроскопией (Leica DM4000), определение стадий клеточного цикла и анализ фракций клеток sub-G1/G1/S-G2 клеток на проточном цитофлуориметре (FACSCanto II, LSRFortessa BD Bioscoences, Guava Millipore), TUNEL-анализ, анализ клеточных популяций при помощи флуоресцентно-меченых антител с использованием FACS анализа.
Биоинформатика