Все потому, что до сих пор не решен вопрос о том, как “измерить” старение. Или, более формально – не определены биомаркеры старения и их количество. Поэтому, не известно и то, что управляет скоростью старения человека и определяет продолжительность его жизни.
Отсутствие воспроизводимого общепризнанного способа однозначно измерить степень старения организма делает невозможным сравнение и валидацию препаратов и других интервенций, направленных на продление жизни долгоживущим организмам. В дополнение, биомаркеры старения помогли бы понять, как должна быть распределена во времени продлевающая жизнь терапия.
Организм - это сложная система с внутренними взаимодействиями. Это ансамбль сцепленных друг с другом функциональных частиц и сигнальных путей.
Молекулы, сигнальные пути, клетки и органы являются частями организма, как сложной сетевой системы. Причем их взаимодействия гибкие, устойчивые и оптимизированные в процессе эволюции.
Молекулярные и другие изменения с возрастом имеют взаимосвязанные эффекты, и не могут рассматриваться как простые парные взаимодействия между молекулами или без взаимодействия друг с другом и с другими функциональными единицами всей системы.
Только изучение влияния совместной динамики возраст-ассоциированных процессов старения может приблизить четкое определение и способ расчета биомаркеров для человека.
Живой организм функционирует, интегрируя регуляторные механизмы на разных масштабах. Нарушения этого процесса вызывают фенотипические и функциональные проявления старения.
На языке физики мы имеем сложную сетевую систему с нелинейной динамикой, на которую действуют внешние и внутренние силы, приводящие со временем к изменению структуры и динамических характеристик системы.
Биомаркеры старения - это такой набор параметров, который однозначно определяет состояние системы в данный момент относительно “полностью состарившейся” системы, которая стремится к состоянию смерти. Следовательно, имея набор этих параметров для конкретного индивида в данный момент времени, можно однозначно понять, какова степень разрушения его организма.
Свойства универсальности и около-критичности говорят о том, что существует группа из нескольких величин, которая определяет эволюцию сети во времени, и, значит, может быть связана с биомаркерами старения. Важно, что число этих независимых величин много меньше количества степеней свободы системы.
Анализ структуры сети позволит понять, как должны выглядеть упомянутые величины и идентифицировать их критические индексы. Это даст представление о биомаркерах старения и ответит на вопрос о их количестве.
Возможно, степень старения организма человека не может определяться одним параметром, и независимых параметров несколько.
С другой стороны, сами критические индексы генно-регуляторной сети могут быть связаны с биомаркерами старения. В процессе старения критические индексы могут также эволюционировать во времени. Более того, скейлинг связывает критические индексы между собой и демонстрирует, что эти параметры не независимы. Это означает, что вычислив и глубоко проанализировав эволюцию хотя бы нескольких (строго говоря достаточно минимум трёх) критических индексов, мы можем найти и проанализировать остальные.
Спектральный анализ для изучения эволюции генно-регуляторных сетей и измерения эффектов интервенций и старения.
Первым этапом, для изучения эволюции структуры таких сетей, мы применили спектральный анализ для матриц смежности сетей коэкспрессии, построенных для различных органов и для разных возрастных групп здоровых людей. Качественно спектры выглядят как показано на рисунке.
Наша задача на данном этапе - понять как именно меняется спектр в процессе старения и как он реагирует на возмущения (лекарства, хронические заболевания, диета). В итоге, связь спектральных характеристик с изменениями в организме приблизит к определению биомаркеров старения.
База Open Genes содержит гены, ассоциированные со старением, а так же их подробные описания. База является многомерной, что еще раз подтверждает, что организм - это сложная система взаимодействующих физиологических единиц.
Такие гены являются интересными вершинами в генно-регуляторной сети, они напрямую или косвенно вовлечены в важные динамические и структурные перестройки в процессе старения.
Регуляторная сеть организма состоит из молекул, которые одновременно выполняют определенную функцию и передают сигналы остальной части системы. Таким образом, биологические сети также являются информационными системами, и информационные потоки имеют важное значение.
Например, интегрины выполняют функцию прикрепления к каркасу матрикса, и функцию передатчика сигнала.
В работе было проведено рассуждение о том, как пути, влияющие на старение, интегрируют информацию. Различные сигналы из внутренней и внешней среды и известные пути старения связаны друг с другом. На выходе получается макроскопический эффект от суммарного сигнала на организм.
Такая модель очень похожа на архитектуру нейронной сети. Биомаркеры старения должны показывать состояние этой сети, а экспрессии генов, ассоциированных со старением - могут быть весами нейронов некоторых внутренних слоев, и определять значения биомаркеров. Важно заметить, что не известно количество входных нейронов, их число может не быть конечным.
Группа с наивысшей достоверностью по ассоциации со старением включает в себя гены, одновременно увеличившие жизнь модельным организмам и в которых найдены полиморфизмы у долгожителей. Группа с высокой достоверностью - это гены, продлившие жизнь в экспериментах но без информации о полиморфизмах.
Ген MYC соответствовал наибольшему количеству признаков старения - 7 признакам, гены AKT1, SIRT1, CEBPB, MTOR - 6 признакам.
Хорошо известны исследования долгожителей, в которых находят полиморфизмы, ассоциированные с долголетием. Однако, списка таких полиморфизмов не достаточно для создания панели генетических анализов на склонность к долголетию. Одна из существенных причин этого - слабая статистическая значимость полученных результатов вследствие генетической гетерогенности и разнообразия условий жизни выборки людей.
Тем не менее, существует способ выбрать полиморфизмы - кандидаты на склонность к долголетию. Это исследование влияния полиморфизмов долгожителей на активность соответствующих им генов, причем только тех, изменение активности которых продлило жизнь лабораторным организмам.
Мы провели такой анализ для мух, мышей и круглых червей.
Молекулярные биомаркеры старения.
Клеточное старение
Клеточное старение определяется как состояние стабильной остановки клеточного цикла. В дополнении к этому происходят фенотипические изменения, включая продукцию провоспалительных факторов SASP. Секретируемый старыми клетками SASP способствует воспалению и дисфункции ткани. Появившееся как компенсаторный механизм, направленный на предотвращение пролиферации поврежденных клеток, старение клеток индуцируется разными возрастными стимулами: укорочением теломер, повреждением ДНК и чрезмерной митогенной сигнализацией. В частности белком-супрессором опухоли p16Ink4a.
Известно, что экспрессия белка p16Ink4A возрастает при старении в различных тканях у животных и человека.
Также было показано, что транскрипция p16Ink4a в Т-лимфоцитах периферической крови положительно связана с возрастом, курением, физической активностью и может быть одним из биомаркеров старения.
Кроме этого, в метаанализе 372 исследований GWAS, направленных на выявление полиморфизмов предрасположенности к возрастным заболеваниям, локус ink4/ark, кодирующий белок p16Ink4a, был связан с самым высоким числом заболеваний, включая болезнь Альцгеймера, сердечно-сосудистые заболевания, рак и сахарный диабет типа 2.
Наиболее часто в качестве биомаркера сенесцентных клеток используется ассоциированная с клеточным старением β-галактозидаза (senescence-associated beta-galactosidase, SA-β-Gal). Фермент β-галактозидаза – это лизосомная гидролаза, которая расщепляет концевую бета-галактозу из содержащих ее соединений (лактозы, кератинсульфатов, сфинголипидов и др.). Ещё в 1995 году было описано, что экспрессия SA-β-Gal значительно возрастает в сенесцентных клетках. Для определения её содержания в стареющих тканях используется иммуногистохимический метод. В качестве альтернативного метода определения активности SA-β-gal в клетках применяется проточная цитометрия с использованием 5-додеканоиламинофлуоресцеина ди-β-D-галактопиранозида в качестве субстрата.
В 2017 году израильские биологи разработали новую, более эффективную технологию на основе проточной цитометрии, с использованием цитометра ImageStreamX. Этот метод позволял обнаруживать SA-β-Gal в тканях с эффективностью более 80 %. Для повышения эффективности анализа учёные вместе с SA-β-Gal определяли ещё несколько биомаркеров клеточного старения – белки HMGB1 и γH2AX. HMGB1 – белок из группы ядерных негистоновых белков HMG, в сенесцентных клетках он покидает ядро и перемещается во внеклеточное пространство. γH2AX – фосфорилированная форма гистона H2AX, является признанным маркером раннего повреждения ДНК и клеточного старения. Кроме этого, новый метод израильских учёных позволял определять стареющие клетки по их увеличенным размерам. По мнению исследователей, их технология может быть использована для быстрого и определения эффективности новых фармацевтических соединений, которые будут специально разработаны для устранения стареющих клеток из тканей.
В этом году Z. Liu и соавторы описали ещё один биомаркер сенесцентности – плацентарный гликопротеин PSG4. Который активировался при старении из-за реорганизации хроматина. Уровни PSG4 также повышались при экспериментальном клеточном старении, вызванном ультрафиолетом и одним из АФК, пероксидом водорода. Что указывает на единообразную активацию PSG в различных контекстах клеточного старения.
Полногеномное секвенирование показало, что сверхэкспрессия PSG4 приводила к репрессии генов, связанных с клеточным циклом, репликацией и репарацией ДНК. И напротив, вызывало активацию генов, связанных с клеточным старением и воспалением. Нокдаун же PSG4 ослаблял старение мехензимальных стволовых клеток.
Анализ транскриптомного профиля фибробластов человека разного возраста показал, что уровни транскриптов PSG4 положительно коррелировали с возрастом в этих фибробластах.
Ученые также исследовали уровни белка PSG4 на протяжении всей жизни человека в ранее опубликованном наборе данных о протеоме плазмы человека, который включает 4263 человека (от 18 до 95 лет). PSG4 был один из белков плазмы, который положительно коррелирует с возрастом. Кроме того, авторы подтвердили повышенный уровень белка PSG4 в крови пожилых людей с помощью ELISA.
TGF-β и GDF11 также считаются белками, играющими роль в клеточном старении, старческой слабости и фиброзе. Ростовой фактор дифференцировки 11 (GDF11) принадлежит к суперсемейству белков TGF-β. Результаты показывают, что GDF11 обладает омолаживающими свойствами с выраженным воздействием на сердечно-сосудистую систему, мозг, скелетные мышцы и скелет у мышей. Также было проведено несколько исследований на людях, которые показали снижение уровня циркулирующего GDF11 с возрастом. Ещё он оказал значительное влияние на продукцию компонентов дермального матрикса на 3D-моделях кожи.
Ещё одним биомаркером клеточного старения могут выступать ассоциированные с клеточным старением гетерохроматиновые домены (SAHF). SAHF – это особые гетерохроматиновые структуры, которые образуются в ядрах стареющих клеток. Их образование связано с инактивацией расположенных на этом участке генов, участвующих в клеточном цикле (MCM3, PCNA, Cyclin A). SAHF можно увидеть под микроскопом после их окрашивания специальным красителем DAPI. Кроме этого, описана повышенная экспрессия промиелоцитарного лейкозного белка (PML) в сенесцентных клетках, который также может быть дополнительным маркером клеточного старения.
SASP является следствием клеточного старения и может возникать в клетках, которые все еще являются метаболически активными и секретируют белки. Основными компонентами факторов SASP являются растворимые сигнальные факторы, включая интерлейкины, хемокины и факторы роста. Белки, которые связаны с SASP, такие как интерлейкин-6, фактор некроза опухоли-альфа, моноцитарный хемотаксический фактор-1 (МСР-1), матриксные металлопротеиназы и IGF-связывающие белки, способствуют старению тканей в сочетании с воспалением.
Созданные каталоги SASP также включают секретируемые протеазы и секретируемые нерастворимые белки, компоненты внеклеточного матрикса.
Нестабильность генома
Ещё один важный механизм старения – геномная нестабильность. Генетическое повреждение накапливается с возрастом из-за внешних и внутренних факторов. Нестабильность генома возникает в результате дисбаланса между повреждением и восстановлением ДНК. Повреждение хромосом можно оценить с помощью микроядерного анализа, который измеряет разрушение хромосом. Микроядра формируются из фрагментов хромосом, образовавшихся в ходе нарушенного клеточного деления или апоптоза. Увеличение содержания в организме клеток с микроядрами связано со старением, раком, нейродегенеративными заболеваниями, употреблением табака.
Также исследования показали, что увеличение микроядер связано со старческой астенией (Frailty).
Ещё одним важным биомаркером геномной нестабильности выступает описанный выше гистоновый белок H2AX. Его фосфорилированная форма, γH2AX, связана с появлением повреждений ДНК. Сывороточные маркеры повреждения ДНК, том числе, cathelin-related antimicrobial peptide (CRAMP), эукариотический фактор элонгации трансляции EF-1a, статмин, N-ацетил-β-D-глюкозаминидаза (NAG) и хитиназа, также были описаны в ряде работ в связи с геномной нестабильностью.
Укорочение теломер
Теломеры представляют собой концевые участки хромосом, которые укорачиваются каждый раз, когда клетки делятся. Это один из наиболее изученных признаков старения, с почти 10 000 публикаций в PubMed на сегодняшний день. Двумя основными методами, используемыми для измерения длины теломер, являются Southern blot (измерение размера ферментативно расщепленных фрагментов теломер) и количественная полимеразная цепная реакция (qPCR).
В недавнем мета-анализе двадцати пяти исследований (где число исследуемых было n=121749, 21763 умерших) укорочение теломер было предиктором смертности от всех причин.
Укорочению теломер можно противодействовать с помощью теломеразы — фермента, способного удлинять теломеры. Теломераза индуцируется в большинстве опухолевых клеток, что делает ее индукцию рискованной. Вместе с этим, активность теломеразы все-таки играет важную роль в долголетии. Исследование 2019 года J. Shay и соавт. показало, что долгожители имеют более активную теломеразу в Т-клетках по сравнению со здоровыми 67-80-летними.
В этом году G. Church с коллегами в исследовании на мышах продлили жизнь животным, повысив у них экспрессию двух генов. Один из них - ген TERT, который играет важную роль в активации теломеразы (второй ген – ген фоллистатина, FST, противодействующий саркопении) .
Ген TERT кодирует белок – теломеразную обратную транскриптазу (TERT), которая входит в состав теломеразы. Поскольку теломераза поддерживает пролиферацию и деление клеток, животные с дефицитом белка TERT имеют более короткие теломеры и более короткую продолжительность жизни.
Что касается фоллистатина - FST - продукта гена FST. В мышечных клетках FST функционирует как негативный регулятор миостатина (белка, который подавляет рост мышечной ткани).
Что касается фоллистатина - FST - продукта гена FST. В мышечных клетках FST функционирует как негативный регулятор миостатина (белка, который подавляет рост мышечной тк
Уже известно, что сверхэкспрессия FST увеличивает массу скелетных мышц у трансгенных мышей аж на 194–327%. происходит это из-за того, что нейтрализуются эффекты различных лигандов TGF-β, которые участвуют как раз-таки в распаде мышечных волокон. Мыши с выключенным FST имеют меньшее количество мышечных волокон, замедленный рост, дефекты скелета и сниженную массу тела, и они умирают в течение нескольких часов после рождения. У старых мышей наблюдается потеря функции двигательных единиц с нарушением передачи нервно-мышечных соединений. Ещё оказывается экспрессия фоллистатина у старых мышей не только увеличивает мышечную массу, но и улучшает нервно-мышечную функцию. Так что можно говорить о терапевтическом потенциале FST при потере мышечной массы и нарушений нервно-мышечной функции, вызванных старением.Нарушение протеостаза
Известно, что внутриклеточный белковый гомеостаз, или протеостаз, поддерживается с помощью нескольких механизмов контроля качества: рефолдинг белка с помощью белков-шаперонов и деградация убиквитин-протеасомной системой и посредством аутофагии. Из-за клеточного стресса, агрегация неправильных белков выступает одним из механизмов старения и связанных с возрастом заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера.
Белок кластерин поддерживает нормальный протеостаз, предотвращая накопление неправильных белков. Происходит это благодаря его функциям: расщепление клеточного «мусора» и регуляция апоптоза. Кластерин участвует в таких разнообразных процессах, как мобилизация фагоцитов, индукция агрегации тромбоцитов, ингибирование мембранной атаки белков комплемента, подавление апоптоза, рециклизация мембран, транспорт липидов и гормонов и ингибирование разрушающих внутриклеточный мусор и межклеточное вещество металлопротеиназ. В одном из исследований ген кластерина фигурировал вместе с ещё двумя генами, связанными с путями NF-kb и протеинкиназы С (NFKBIA и PRKCH), как ключевой фактор исключительного долголетия у людей.
Несколько исследований показали связь между уровнем кластерина и возрастными заболеваниями.
Так, Riwanto и соавт. описал, что снижение уровня ЛПВП-ассоциированного кластерина связано с ишемической болезнью сердца.
Также кластерин показал себя в качестве биомаркера возрастной нейродегенерации, связанной с нарушением протеостаза.
Митохондриальная дисфункция
Старение человека обычно связано с прогрессирующей митохондриальной дисфункцией. Среди важных параметров, участвующих в этой дисфункции, выступает снижение эффективности дыхательной цепи, наблюдаемое при старении. Это снижение характеризуется повышением продукции активных форм кислорода (АФК) и дисфункцией митохондрий.
GDF-15 - это стресс-индуцированный цитокин и член суперсемейства трансформирующего фактора роста β. GDF-15 рассматривается сегодня как диагностический маркер для наследственных митохондриальных заболеваний и как маркер митохондриальной дисфункции. Кроме прочего GDF-15 вовлечен в старение и различные возрастные расстройства, такие как сердечно-сосудистые заболевания и диабет.
Исследования показывают, что апелин, индуцированный физическими упражнениями миокин, также может рассматриваться как предполагаемый биомаркер старения, связанный с митохондриальной дисфункцией. Апелин усиливал мышечную функцию посредством митохондриогенеза, а также других путей, связанных с признаками старения: аутофагии, воспаления и мышечных стволовых клеток.
Биомаркеры окислительного стресса также считаются классом биомаркеров старения. Окислительный стресс это некоторый дисбаланс между оксидантами (АФК) и антиоксидантной защитой организма. Молекулы, образующиеся при окислении, могут служить биомаркерами, поскольку их анализ в различных биологических матрицах используется для количественной оценки окислительного стресса у человека.
Наиболее значимый маркер окислительного стресаа - 8-изопростагландин F2α - биомаркер повреждения фосфолипидов при перекисном окислении липидов. Продукты окислительного повреждения белков включают о-тирозин, 3-хлортирозин и 3-нитротирозин. 8-гидрокси-2'-дезоксигуанозин и 8-гидроксигуанозин показывают окислительные повреждения нуклеиновых кислот.
Концентрация этих биомаркеров в жидкостях организма может быть обнаружена с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии. Shen и соавт. сконструировали циркулярно-перестроенный желтый флуоресцентный белок (cpYFP), экспрессируемый в митохондриальном матриксе Caenorhabditis elegans в качестве датчика окислительного стресса и метаболических изменений.
Потенциалом использования в качестве биомаркеров митохондриальной дисфункции и окислительного стресса обладают и эндогенные антиоксиданты: глутатион, цистеин, мочевая кислота и убихинол. При взаимодействии с активными формами кислорода эндогенные антиоксиданты окисляются, но затем снова восстанавливаются при помощи специальных ферментов. Поэтому в организме молекулы антиоксидантов присутствуют в двух формах: восстановленной форме (антиоксидантой) или окисленной (после реакции с оксидантами). При помощи хроматографического метода возможно фиксировать отношение восстановленных и окисленных форм антиоксидантов и таким образом определять степень окислительного стресса.
Истощение стволовых клеток
Репаративный и регенеративный потенциал многих тканей снижается с возрастом, что связано с функциональным истощением в нескольких пулах стволовых клеток (гемопоэтических, нервных, мезенхимальных, кишечных эпителиальных стволовых клеток).
Взрослые стволовые клетки присутствуют в каждой ткани и органах после развития и регенерируют поврежденные ткани на протяжении всей жизни. Во время старения функция стволовых клеток снижается. Истощение стволовых клеток рассматривается как интегративное следствие нескольких признаков старения, описанных выше, включая повреждение ДНК, эпигенетические изменения, укорочение теломер, старение клеток и митохондриальную дисфункцию.
Истощение стволовых клеток трудно измерить неинвазивно до наступления его клинических последствий. Таких, как анемия и цитопении (т.е. клеточный дефицит) для гемопоэтических стволовых клеток, а также саркопения для мышечных стволовых клеток и снижение функции кишечника для кишечных эпителиальных стволовых клеток. До сих пор имеется мало данных о потенциальных биомаркерах этого признака старения. Циркулирующие остеогенные клетки-предшественники были предложены в качестве суррогатного маркера популяции мезенхимальных стволовых клеток в костном мозге.
Процент остеогенных клеток-предшественников обратно коррелировал с возрастом. Также более низкие уровни этих клеток были связаны с астенией, более низкой физической работоспособностью (измеряемой силой захвата и скоростью ходьбы) и инвалидностью, независимо от возраста и сопутствующей патологии.
Измененная межклеточная коммуникация
Старение связано с изменениями в коммуникации между клетками и хроническим воспалением, inflammaging. Это воспаление рассматривается как следствие нескольких признаков старения, описанных выше, в том числе клеточного старения (через SASP) и потери протеостаза. Поскольку неправильно свернутые белки формируют сигнал опасности, который запускает врожденный иммунный ответ.
Одним из главных путей воспаления выступает сигнальный путь инфламмасом. Инфламмасома представляет сложную систему внутриклеточных белков, которые собираются при обнаружении сигналов стресса и опасности. Они запускают созревание и высвобождение провоспалительных цитокинов (интерлейкина-1β и интерлейкина-18). Мышиные модели, лишенные инфламмасомы NLRP3, демонстрируют уменьшение воспаления, непереносимости глюкозы, дегенерации гиппокампа, нейровоспаления. А чрезмерная активация инфламмасом связана с такими заболеваниями, как болезнь Альцгеймера, диабет, атеросклероз, артрит и подагра.
У пожилых людей от 60 до 90 лет активация инфламмасом (измеренная по экспрессии генов nlcrc4 и nlrc5 и продукции интерлейкина-1β) была положительно связана с артериальной гипертензией и артериальной жесткостью и отрицательно связана с личным и семейным долголетием.
Кристаллы холестерина и β-амилоидные белки могут инициировать сборку воспалительных комплексов инфламмасом. Этот путь участвует в прогрессировании атеросклеротического поражения и нейровоспалении при болезни Альцгеймера.
Помимо воспаления, immunosenescence включает количественные и функциональные изменения множества факторов как врожденных, так и адаптивных звеньев иммунной системы.
Immunosenescence может усугублять процесс старения, связанный с описанными выше признаками старения, в частности из-за неспособности уничтожать патогенные микроорганизмы. А также предраковые клетки, стареющие клетки и неправильно свернутые белки. A. Alpert с коллегами создали показатель траектории иммунного старения IMM-AGE, на основе которого можно предсказывать риски смертности от всех причин.