научный обзор

Альтернативный сплайсинг


Артём Токарчук

18 ноября 2022
Сплайсинг
При старении возрастает риск многих заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, болезней сердечно-сосудистой системы, рака. Существуют теории старения, связанные с накоплением мутаций, эволюцией, свободными радикалами и прочие. Каждая теория имеет свои практические подтверждение, но не описывает весь процесс и его причины целиком. Открытым остается вопрос, является ли старение болезнью, или нормальным течением жизни. Так или иначе, старение — это системный процесс, затрагивающий весь организм и приводящий к нарушению его функциональности. Старение затрагивает все уровни биологической организации — от уровня фенотипа до молекулярно-генетических основ.
Старение, безусловно, связано с геномом. У некоторых организмов вероятность смерти вообще не увеличивается с возрастом, например у гидр, другие, например, голые землекопы, обладают уникально большой продолжительностью жизни, не свойственной грызунам. Долголетие людей также связано с генетикой — дети родителей, проживших более 80 лет, живут в среднем на 6 лет дольше чем в популяции. Исследования близнецов говорят о примерно 25%-ом вкладе наследственности в долголетие (Herskind et al., 1996; Skytthe et al., 2003). Важным фактором являются не только сами генетические вариации, но и то как регулируется реализация генетической информации. Сперва с генов считывается комплементарная РНК с информацией об аминокислотной последовательности белков, затем с матрицы РНК синтезируются белки. Совокупность всей РНК — транскриптом отражает активность генов, синтез и созревание РНК значимы для многих биологических процессов, в том числе и старения.

Долгое время считалось, что один ген кодирует один белок, а РНК выступает только посредником. Затем, была открыта прерывистая структура генов эукариот (ядерных организмов — животных, растений и грибов), оказалось, что относительно небольшие кодирующие участки гена — экзоны перемежаются с некодирующими последовательности — интронами. В ходе созревания из РНК вырезаются интроны, а экзоны сшиваются, этот процесс называется сплайсингом. Возникает вопрос, зачем эукариотам в отличие от бактерий тратить лишнюю энергию на синтез очень длинных молекул ДНК и РНК, раз для трансляции белка необходима лишь малая их часть? Ответ лежит в плоскости нового уровня регуляции — становится возможным альтернативный сплайсинг, в ходе которого могут оставаться интроны или вместе с ними могут вырезаться экзоны в различных комбинациях, все это приводит к значительному увеличению разнообразия белков. С помощью альтернативного сплайсинга человеческая клетка способна синтезировать не менее 100 тысяч изоформ белков, в то время как число генов приблизительно равно 20 тысячам. Один экзон, как правило, соответствует одному функционально-структурному домену белка, в результате альтернативного сплайсинга образуются похожие белки с разными свойствами. Изоформы могут обладать ткане-специфичностью и меняться при развитии организма. За открытие сплайсинга Рич Робертс и Фил Шарп в 1993 году получили нобелевскую премию по физиологии и медицине.

При старении изменяется профиль альтернативного сплайсинга и экспрессии белковых изфором в тканях и органах человека. Например, в мозге происходит усиление экспрессии и накопление прогерина — дефектной укороченной формы белка ламина, лишенной одного из экзонов, что приводит к клеточному старению (Mazin et al., 2013).

Схемы транскрипции РНК и спласинга (Clancy, 2008)

ДНК эволюционно более «продвинутых» организмов чаще и в большем количестве содержит интроны. Размеры интронов в целом также соответствует этому тренду. У человека встречаются настолько большие интроны, что внутри них помещается отдельный ген. Такие гены называются «вложенными» и они зачастую имеют другой паттерн экспрессии и не связаны функционально с «внешним геном», в интроне которого находятся. Количество таких генов у человека оценивается в 158 функциональных и 212 псевдогенов (Kumar et al., 2005).
Распределение среднего числа интронов в генах эукариот. Более чем 95% генов человека содержат интроны. Один человеческий ген в среднем имеет 8.8 экзонов и 7.8 интронов. Roy & Gilbert, 2006.
Распределение длин интронов в генах эукариот. S. ce., S. cerevisiae; C. el., C. elegans; D. me., D. melanogaster; A. th., A. thaliana; H. sa., Homo sapiens. Lim et al., 2001.
Механизмы сплайсинга. Альтернативный сплайсинг
Для сплайсинга необходимы три функционально важных консервативных участка пре-мРНК:
  • 5’- сайт сплайсинга (5’SS — 5' splice site)
  • 3’- сайт сплайсинга (3’SS — 3' splice site)
  • место разветвления (BS — branch site)

На первой стадии 2’-гидроксил аденозина места разветвления атакует фосфодиэфирную связь 5’SS. В итоге этой атаки образуется структура “лассо” и свободный 3’-гидроксил 5’-концевого экзона.
Во время второй стадии 3’-гидроксил атакует 3’SS. В результате экзоны оказываются ковалентно соединенными обычной межнуклеотидной связью, а интрон уходит в виде структуры “лассо”.

Эти реакции катализируются сплайсосомами — большими комплексами белков и малых ядерных РНК (мяРНК), мяРНК комплементарно связываются с сайтами сплайсинга и направляют белковые факторы [House and Lynch 2008].

Благодаря тому, что лишь 2 нуклеотида 5’SS и 3’SS почти всегда инвариантны, а остальные же менее консервативны, становится возможной регуляция альтернативный сплайсинга.

Схематическое изображение процесса сплайсинга.
Структура сплайсосомы.PDB entry 5YLZ. Wan et al., 2017.
a) Схематическое изображение процесса сплайсинга.
b) Прохождение сплайсинга параллельно с транскрипцией пре-мРНК.

Chabot & Shkreta, 2016.
Основная задача сплайсинга состоит в вырезании некодирующих интронов, однако при альтернативном сплайсинге интроны могут удерживаться в транскрипте, что как правило ведет к деградации РНК. Также возможно вырезание экзонов и их сшивка в различных комбинациях. Разные варианты альтернативного сплайсинга одной пре-мРНК могут проявляется на разных стадиях развития организма, а также в разных его тканях.
Разновидности событий альтернативного сплайсинга. Shi et al., 2018.
Прямоугольники — экзоны,
линии — интроны,
синие уголки — вырезание фрагмента в ходе сплайсинга.
Альтернативно сплайсируются до 95%-ов мульти-экзонных генов человека (Pan et al., 2008). Особенно активно альтернативный сплайсинг происходит в мозге, печени, легких, семенниках и коже (Yeo et al., 2004).
Доли альтернативно сплайсируемых генов от их общего числа в 16 тканях человека. Yeo et al., 2004
Регуляция сплайсинга.
Факторы сплайсинга
В выборе сайтов альтернативного сплайсинга участвуют белковые факторы (SF — splicing factors) и привлекающие их последовательности пре-мРНК.

Существуют два основных семейста SF, взаимодействующих с РНК и сплайсосомами:
  • SR — the serine-arginine rich proteins;
  • hnRNP — heterogenous nuclear ribonucleoproteins.

SR связываются с последовательностями энхансеров сплайсинга (SE) и активируют сплайсинг на ближайших сайтах.
hnRNP же связываются с последовательностями сайленсеров сплайсинга (SS) и подавляют сплайсинг на ближайших сайтах.

SE и SS последовательности находятся как в экзонах (ESE и ESS), так и внутри интронов (ISE и ISS).

Мутации в этих последовательностях могут нарушить выбор сайтов сплайсинга и функциональность транслированных белков.

В совокупности, мутации в сайтах сплайсинга, регуляторных элементах и окружающих их последовательностях позволяют классифицировать сайты сплайсинга как «сильные» или «слабые». Эпигенетические факторы, такие как метилирование ДНК и модификации нуклеосом также влияют на выбор сайта сплайсинга. SF обладают доза-зависимым эффектом поэтому уровень их экспрессии и регуляция влияет на выбор сайтов сплайсинга (Geuens et al., 2016, Pradeepa et al., 2012).

Включение или исключение экзона в результате альтернативного сплайсинга в зависимости от взаимодействий факторов сплайсинга с регуляторными последовательностями пре-мРНК. Wang et al., 2008.
Изменения экспрессии факторов сплайсинга (SF) с возрастом
Изучение возраст-зависимых профилей экспрессии выявили изменения генов, ассоциированными с процессингом РНК, в том числе со сплайсингом. Возраст-зависимые изменения уровней SF обнаружены в различных организмах (человеке, мышах, крысах, дрозофилах) и тканях (крови, коже, мышцах, мозге и печени). Предполагается, что более 50% возраст-зависимых изменений альтернативного сплайсинга связаны с изменениями в активности SF (Mazin et al., 2013; Meshorer & Soreq, 2002).

Изучение клеток периферической крови с помощью ДНК-микрочипов двух когорт людей возрастов с 30 до 104 лет и с 15 до 94 лет выявили снижение уровней экспрессии примерно 40% SF (Harries et al, 2011; Holly et al., 2013). При этом изменение экспрессии SFs HNRNPM и HNRNPA0 и компонента сплайсосом AKAP17A были ассоциированы с когнитивными нарушениями (Lee, Pilling, et al., 2019). Исследования крови методом RNA-seq подтвердили снижение экспрессии SRSF1, SRSF6, HNRNPD, HNRNPH3, LSM2, LSM5 и многих других SF с возрастом (Peters et al., 2015). В другом сравнении крови 70-ти и 80-ти летних доноров обнаружилась апрегуляция функций процессинга РНК и экспрессии SF (Balliu et al., 2019), что может говорить о не совсем линейных изменениях SF и о необходимости более точного и унифицированного определения «молодых» и «старых» доноров, которые могут меняться от иследования к исследованию. Глобальные изменения SF в клетках крови могут влиять на возраст-зависимую дифференциальную экспрессию более 500 интронов (Balliu et al., 2019).

В коже людей и мышей с возрастом так же наблюдается тренд на снижение экспрессии генов SF, например SRSF9, DDX1, DDX3X, DHX15 (Glass et al., 2013, Kadota et al., 2020). Эти наблюдения подтверждались протеомным исследованием кожных фибробластов (Waldera-Lupa et al., 2014).

В противоположность крови и коже исследования в мышцах выявили апрегуляцию уровней экспрессии SF RBFOX1, CELF1, CELF2 и MBLN1, а также множества факторов семейств SR и hnNRP на уровне мРНК (Welle et al., 2003, 2004), и повышение на уровне белков SF3B1, SRSF1, HNRNPA1, HNRNPAB а также 53 белковых компонент сплайсосом (Ubaida-Mohien et al., 2019). Интересно, что некоторые из апрегулированных SF участвуют в специфичном для мышц альтернативном сплайсинге (Nakka et al., 2018) и в ответе мышц на повреждения вызванные токсинами (Orengo et al., 2011). Таким образом, повышение уровней экспрессии SF на уровне РНК и белков в мышцах может иметь компенсаторный и регенеративный характер в ответ на возраст-зависимые изменения в мышцах.

В мозге наблюдаются уникальные паттерны альтернативного сплайсинга и экспрессируются специфичные для него SF. Исследование височной коры больших полушарий среди людей возрастов 16-102 лет также выявило тренд на снижение экспрессии многих компонент сплайсосом и SF (ESPR1, ESPR2, HNRNPK, SNRPB2, SRSF2) (Tollervey, Curk, et al., 2011). Эти данные подтверждаются исследованиями на мышах (Kadota et al., 2020). В фоторецепторах дрозофилы также обнаружен тренд на понижение экспрессии более 30 гомологов человеческих SF с возрастом (Hall et al., 2017; Stegeman et al., 2018).

SF, ассоци-ированные с продолжитель-ностью жизни и старением
Как мы видели выше, с возрастом происходит снижении экспрессии центральных факторов сплайсинга, таких как SRSF и LSM белков. Снижение SF — HNRNP коррелирует со снижением умственных способностей (Lee et al. 2019; Holly et al., 2013). При этом повышенная же экспрессия факторов HNRNPA1 и HNRNPA2B, коррелирует с долголетием мышей и людей. Так же усиленная экспрессия центральных факторов сплайсинга в селезенке и мышцах наблюдается в молодом возрасте долгоживущей линии мышей, что может свидетельствовать о механизме продления жизни в том числе благодаря высокой экспрессии этих белков (Lee et al. 2016).

Нокдаун в Caenorhabditis elegans ортолога человеческого компонента сплайсосом SF1 аннулирует продление жизни на диете с ограничением калорий, но не влияет на C. elegans на обычной диете. Механизм действия SF1, вероятно, связан с регуляцией путей TORC1 и AMPK. Дополнительное ингибирование ортологов человеческих компонент сплайсосом SF3A2, SNRPD3, SNRNPB, HNRNPR, U2AF35 и U2AF65 значительно снижает продолжительность жизни C. elegans как на диете, так и без нее. (Heintz et al., 2017).

Многочисленные исследования, несмотря на методологические различия, указывают на дисрегуляцию многих SF при старении, механизм этого явления не известен, но вероятно связан с эпигенетическими изменениями, соматическими мутациями, изменениями в сигнальных каскадах и самом альтернативном сплайсинге. Исследования не выделяют один конкретный SF или компонент сплайсосом, или их небольшую группу, которые могли бы быть «мастер-регуляторами», вероятно при старении происходит комплексный процесс дерегуляции факторов сплайсинга (Angarola & Anczuków, 2020).

Изменения сплайс-изоформ белков с возрастом
Если при старении наблюдаются столь драматичные изменения в экспрессии SF, это должно повлиять на даунстрим изменения альтернативного сплайсинга и белковых изоформ.

Анализ 2011-го года лейкоцитов периферической крови ДНК-микрочипами выявил 10 дифференциально сплайсирующихся с возрастом генов (Harries et al., 2011). Более поздний анализ RNA-seq определил альтернативный сплайсинг около 300 генов при сравнении доноров 70 и 80 лет. (Balliu et al., 2019). В исследовании более 48 тканей человека от более 500 доноров возрастов от 39 до 85 лет найденные изменения в сплайсинге были в большей степени ткане-специфичными, наибольшее количество альтераций — более 1000 было найдено в коже и слизистой пищевода. При этом профили альтернативного сплайсинга лучше предсказывали биологический возраст ткани, чем профили экспрессии генов в целом (Wang, Wu, et al., 2018).

Возраст-зависимые изменения сплайсинга затрагивали гены, участвующие в репарации ДНК, апоптозе, рибосомных и митохондриальных функциях. Интересно, что среди топ функциональных категорий меняющихся из-за альтернативного сплайсинга встречается процессинг РНК и сам альтернативный сплайсинг (Balliu et al., 2019; Rodriguez et al., 2016; Sieber et al., 2019; Wang, Wu, et al., 2018).

Глобальные изменения альтернативного сплайсинга наблюдаются при старении в мозге, с использованием RNA-seq технологии были получены данные об около 300 событий альтернативного сплайсинга в префронтальной коре и мозжечке при старении индивидуумов от 25 до 98 лет, включение интрона в транскрипт было наиболее частым явлением. В этой работе было также показано постепенное нарастание с возрастом экспрессии прогерина — дефектной формы белка ламина, вызывающую клеточную сенесценцию и связанного с преждевременным старением при синдроме Хатчинсона — Гилфорда (Mazin et al., 2013). Другое, ДНК-микрочиповое исследование височной коры определило 1174 экзона с возраст-зависимыми изменениями сплайсинга, интересно, что эти изменения коррелируют с изменениями сплайсинга людей больных нейродегенеративными заболеваниями (Tollervey, Curk, et al., 2011). В исследовании гиппокампа мышей альтернативный сплайсинг был найден в генах, которые сами не показывают дифференциальную экспрессию с возрастом (Stilling et al., 2014).

Удержание интронов в транскриптах — наиболее частое возраст-зависимое событие альтернативного сплайсинга, которое особенно выражено в мозге и кожных фибробластах модельных организмов и человека (Adusumalli et al., 2019; Mazin et al., 2013; Yao et al., 2020). В мышцах чаще встречаются кассетные экзоны (Ubaida-Mohien et al., 2019). В целом же паттерны альтернативного сплайсинга тканеспецифичны. Для дальнейшего понимания механизмов их действия необходимы также и функциональные исследования на уровне белков.

Альтернативный сплайсинг и биомаркеры старения
Несмотря на ткане-специфичные особенности, при старении происходят общие нарушения на молекулярном и клеточном уровне: эпигенетические изменения, увеличивается нестабильность генома, возникают митохондриальные и метаболические дисфункции, укорачиваются теломеры, накапливаются сенесцентные клетки, нарушается протеостазис, меняются коммуникации между клетками, присутствует хроническое затяжное вялотекущее воспаление. Многие альтерации сплайс-изоформ происходят в белках, вовлеченных во все эти процессы, маркирующие старение.
Angarola & Anczuków, 2020
1
Метаболизм. Ограничение калорий.
Диета с ограничением каллорий ведет к увеличению продолжительности жизни модельных организмов, при этом как в мышах, так и в червях Caenorhabditis elegans сотни генов, регулирующие метаболизм, клеточный сигналинг, процессинг белков и регуляцию РНК, меняют профиль альтеранттивного сплайсинга. В C. elegans эти события регулируются, хотя бы от части, ортологами человечкских SF HNRNPU и SF1, нокдаун которых подавляет увеличение продолжительности жизни при диете (Tabrez et al., 2017).

При ограничении калорий, гены, контролирующие метаболизм РНК и альтернативный сплайсинг, меняют свою экспрессию как в мышах (гены Cpsf6, Srrn2, Luc7l2, SRm300, Prp44b, Prpf39, Sfpq, Sf3b1 и Sfrs18), так и в макаках-резус (гены LSM2, LSM4, SRSF1, SRSF7, NCBP1, PHF5A, PRPF8, ACIN1, RBM8A и DDX46), что подтверждается также на протеомном уровне (Swindell, 2009; Rhoads et al., 2018).

Эти результаты позволяют предположить широкое вовлечение сплайсинга в увеличении продолжительности жизни при ограничении калорий.
2
Метаболизм. Инсулин- и IGF1-сигнальные пути.
Пониженный IGF-сигналинг ассоциирован с увеличением продолжительности жизни у плодовых мушек D. melanogaster, мышей и червей C. elegans (Altintas et al., 2016). Ключевые участники этих сигнальных путей подвергаются альтернативному сплайсингу, так в результате сплайсинга образуется как минимум три изоформы IGF-1: IGF-1 Ea, IGF-1 Eb, IGF-1 Ec (также известный как MGF). Экспрессия трансгенных форм IGF-1Ea или IGF-1Eb в мышах имеет защитный эффект при возрастной саркопении — понижении силы и массы скелетных мышц, вызванной дисбалансом синтеза и разрушения белков (Ascenzi et al., 2019).

Рецепторы инсулина также подвергаются альтернативному сплайсингу. Пропуск или включение 11-го экзона в рецепторе IR соответствует двум изоформам рецептора — A и B, обладающих разной афинностью к инсулину у млекопитающих. Соотношение форм A/B IR ассоциировано с устойчивостью к инсулину, старением и повышенной пролиферацией нормальных и неопластических тканей. В модуляции соотношения A и B изоформ участвуют факторы сплайсинга CUGBP, MBNL и hnRNPs белки (Belfiore et al., 2017). C. elegans и D. melanogaster, также экспрессируют несколько изоформ IR, одна из которых не имеет цитоплазматического тирозинкиназного домена и выступает как ловушка для инсулина — IR связывается с ним, но не передаёт сигнал в клетку. Оверэкспрессия короткой изоформы IR в C. elegans ведет к увеличению продолжительности жизни (Martinez et al., 2020; Vastermark et al., 2013).
3
Метаболизм. mTOR и AMPK сигнальные пути.
Существует также не очень детально изученные связи между сплайсингом, mTOR и AMPK сигналингом. mTOR в составе комплекса mTOR1 активируется в ответ на поступление питательных веществ и стимулирует анаболизм. Подавление mTOR1 рапамицином или вследствие голодания, или же генетического нокдауна mTOR ведет к увеличению продолжительности жизни модельных организмов, в том числе млекопитающих (Liu & Sabatini, 2020). Ограничение калорий C. elegans ведет к изменению альтернативного сплайсинга, регулируемого ортологами человеческих SF SF1 и SF3A2. Оверэкспрессии SF1 при этом достаточно для увеличения продолжительности жизни. Более того, нокдаун SF1 подавляет фенотип долголетия линий C. elegans с мутациями в mTOR и AMPK, что вероятно позволяет определить SF1 как даунстрим эффектор mTOR и AMPK (Heintz et al., 2017).

AMPK, в отличие от mTOR, активируется при низких уровнях энергии, стимулирует катаболизм и подавляет анаболизм. Фармакологическая активации AMPK метформином увеличивает продолжительность жизни мышей, C. elegans и D. melanogaster. При этом происходит подавление фактора сплайсинга RBM3, однако неизвестно происходит ли это напрямую из-за активации AMPK (Laustriat et al., 2015).
4
Метаболизм. Митохондриальная дисфункция и активные формы кислорода.
Накопление активных форм кислорода (ROS) вследствие прогрессирующей дисфункцией митохондрий вовлечено в старение, однако до сих пор не ясно вызывает ли оно старение или является одним из его следствий (Back et al., 2012; Blagosklonny, 2008; Liguori et al., 2018). Повреждение митохондрий и накопление ROS ведет к изменению паттерна альтернативного сплайсинга апоптозных генов CASP3, CASP8, CASP9, APAF1 и транскрипционных факторов SIP1, SF SMN. Интересно, что эти события альтернативного сплайсинга коррелируют с недостатком АТФ, но не с накоплением ROS без прямого повреждения митохондрий (Maracchioni et al., 2007).
5
Укорочение теломер и сплайсинг.
Концевые участки хромосом — теломеры предотвращают потерю информации ДНК из-за укорочения хромосом при делении, защищают от межхромосомных соединений и нуклеазной деградации ДНК. При каждом делении ДНК длина теломер уменьшается и при достижении критического уровня — клетка переходит в состояние репликативной сенесценции или подвергается апоптозу. Длина теломер может выступать одним из биомаркеров старения, ускоренное укорочение теломер ассоциировано с ранним началом таких возраст-зависимых заболеваний как коронарная недостаточность, диабет, остеопороз и повышенным риском развития рака. Повреждение теломер в человеческих фибробластах ведет к альтернативному сплайсингу белков, связанных с регуляцией цитоскелета, пролиферацией и метаболизма, а также к накоплению дефектной формы ламина A — прогерина, связанного с преждевременным старением при синдроме Хатчинсона — Гилфорда (Cao et al., 2011).

Теломераза, фермент удлиняющий теломеры, активна в половых, кроветворных и стволовых, но не соматических клетках. Зачастую в раковых клетках активность теломеразы повышена (Shay & Wright, 2019). В результате альтернативного сплайсинга обратной транскриптазы hTERT — основного компонента теломеразы, образуется как минимум 22 сплайс-изоформ с разной активностью. Их экспрессия отличается в разных клеточных типах и при развитии организма. Реактивация теломеразы в раковых клетках зачастую включает в себя образование полноразмерной формы hTERT, тогда как многие другие сплайс-изоформы теряют домены с теломеразной активностью (Wong et al., 2014). Альтернативный сплайсинг hTERT регулируется SF hnRNPK, hnRNPD, SRSF11, hnRNPH2, hnRNPL, NOVA1 и PTBP1. NOVA1 и PTBP1 при этом усиливают продукцию полной формы hTERT, поддерживающую длину теломер в активно делящихся раковых клетках (Pont et al., 2012; Sayed et al., 2019).

6
Клеточная сенесценция и сплайсинг.
Сенесценция наступает при исчерпании репликативного потенциала клетки или из-за стрессового воздействия. При старении сенесцентные клетки накапливаются в органах и тканях и, помимо нарушения их функциональности, стимулируют воспаление. В таких клетках наблюдаются повышенное образование активных форм кислорода, потеря ламина в ядерной оболочке, провоспалительный секреторный фенотип и экспрессию β-галактозидазы, ассоциированные с сенесценцией (Sikora et al., 2014).

При сенесценции меняют профиль сплайсинга белки эндоглин и p53 с образованием p53β, которые далее рассмотрены подробнее.

p53 может также сплайсироваться в форму Δ40p53 с потерянным первым трансактивационным доменом, сверэкспрессия этой формы белка в мышах вызывает ускорение старения и клеточной сенесценции. В то время как полноразмерный p53 снижает экспрессию IGF-1 (Werner et al., 1996), Δ40p53 активирует клеточное старение по средством гиперактивации IGF сигналинга, активации p21 и ареста клеточного цикла (Deschenes & Chabot, 2017).

Увеличение экспрессии короткой формы EXOC7, вовлеченного во внутриклеточный транспорт ведет к усилению провоспалительного секреторного профиля, характерному для сенесцентных клеток. Альтернативный сплайсинг EXOC7 регулируется фактором PTBP1 (Georgilis et al., 2018). Изменение экспресии PTBP1 как и других SF имеет большое значение при сенесценции.

Angarola & Anczuków, 2020
7
Клеточная сенесценция и факторы сплайсинга.
При сенесценции наблюдается снижение экспрессии фактора SRSF7 (Kadota et al., 2020) и предсказано снижение факторов QKI, RBFOX2, PTBP1, HNRNPK, HNRNPM и HNRNPUL1 согласно транскриптомным данным (Dong et al., 2018).

Снижение экспрессии сплайсинг фактора U2AF1 при репликативной сенесценции вызывает удержание интронов в сотнях транскриптов, что веде к понижению их функциональной экспрессии из-за деградации РНК. Нокдаун одного из его мишеней — белка CPNE1 с наибольшей частотой включения интрона, вызывает характерный для сенесценции фенотип в молодых клетках, подтверждая роль удержания интронов при клеточном старении (Yao et al., 2020).

Гомологи ресвератрола, вещества, способного обратить сенесцентный фенотип и продлить жизнь модельных организмов, ведут к повышению уровней экспрессии центральных факторов сплайсинга (Latorre et al., 2017).

В противоположность мышиным и человеческим моделям, клетки голого землекопа, уникального долгоживущего организма, демонстрируют небольшие изменения уровней факторов сплайсинга с течением времени (Lee et al., 2020).

Существует предположение о том, что глобальная дисрегуляция факторов сплайсинга и компонент сплайсосом может быть одной из причин сенесценции, исследование репликативной и стресс-индуцированной сенесценции фибробластов показало изменения в экспрессии 58 генах, ассоциированных со сплайсингом, и эти изменения происходили до проявлений клеточного старения, в частности, до детекции активности β-галактозидазы, ассоциированной с сенесценцией (Kwon et al., 2021).

Таким образом, модуляция уровней факторов сплайсинга, генетическая или фармакологическая, может иметь большой потенциал для откладывания, обращения или предотвращения клеточного старения.
8
Сенесценция и альтернативный сплайсинг. In vitro эксперимент на фибробластах.
Фибробласты — самые распространенные клетки соединительной ткани, секретирующие белки внеклеточного матрикса — коллаген, эластин, гликозаминогликаны и гликопротеины.

Известный супрессор опухолей — белок p53 играет важную роль в различных биологических процессах, в том числе и в клеточном старении. При старении происходит снижение экспрессии фактора сплайсинга SRSF3, p53 при этом альтернативно сплайсируется в изоформу p53β с уникальным включением 9-го экзона.

Выключение - нокдаун SRSF3 с помощью siRNA вызывает повышение экспрессии изоформы p53β и усиление признаков старения клеток на ранних пассажах культивирования (Tang et al., 2013).
Tang et al., 2013
9
Сенесценция и альтернативный сплайсинг. In vitro наблюдение за эндоглией.
Белок Endoglin (ENG) расположен в клеточной мембране и участвует в ангиогенезе.
В молодых активно пролиферирующих клетках последний интрон гена ENG вырезается минорной сплайсосомой в цитоплазме, от основной же ядерной сплайсосомы интрон спасет белок ASF/SF2. При старении ASF/SF2 выходит в цитоплазму, в результате интрон не вырезается и там, происходит удержание интрона и образование S-формы белка.

Оверэкспрессия S-эндоглина в трансгенных мышах ассоциирована с гипертонией, пониженным ответом на оксид азота NO и другими признаками сосудистых патологий (Blanco et al., 2011).

Мутации в гене ENG вызывают болезнь Рандю — Ослера (семейная наследственная телеангиэктазия), приводящей к аномалии сосудов и кровотечениям, в том числе во внутренних органах. С возрастом ее симптомы значительно усиливаются, вероятно это может быть связано с преобладанием длинной формы ENG — S-эндоглина с удержанным интроном (Harries et al., 2011).
Blanco et al., 2011
10
Геномная нестабильность.
Дефекты системы репарации и накопление мутаций ДНК ассоциированы с повышенной скоростью старения у людей и мышей (Niedernhofer et al., 2018).

Существуют механистические связи между повреждением ДНК, системой репарации, системой апоптоза и сплайсингом. Так гены BRCA1, ATM, CHK2 и TP53, вовлеченные в контроль репарации ДНК, имеют различные сплайс изоформы (Kumaraswamy, & Jensen, 2019). Факторы сплайсинга, такие как SR и HNRNP, меняют профили сплайсинга, фосфорилирования и ацетилирования в ответ на повреждение ДНК (Siam et al., 2019). Один из генов, регулирующих апоптоз — BCL2L1, может сплайсироваться в формы BCL-xL и BCL-xS, первая из которых предотвращает, а вторая активирует апоптоз, его сплайсинг регулируется при этом фактором SRSF10 в зависимости от повреждений ДНК (Shkreta et al., 2011).

Ниже рассмотрим примеры взаимодействия систем сплайсинга и несколькими ключевыми белками ДНК репарации, ассоциированными также со старением - BRCA1, ATM, PRMT5 и PARP1.

BRCA1 участвует в поддержание стабильности ДНК и контроле клеточного цикла. Мыши с гомозиготной делецией Brca1 имеют повышенный уровень клеточной сенесценции и апоптоза (Xu et al., 2001). BRCA1 в первую очередь необходим для построения пространственной структуры для привлечения других белков к репарации повреждений ДНК, однако он также взаимодействует с BCLAF1, совместно с которым образует комплекс с SF, необходимый для сплайсинга ATRIP, BACH1, and EXO1 — факторов репарации ДНК (Savage et al., 2014).

ATM — сигнальная киназа, активируемая двухцепочечными разрывами ДНК и действующая апстрим p53. ATM и связанные с ней белки постепенно снижаются при репликативной сенесценции в культуре клеток человека in vitro и в мышином мозге in vivo. При этом воздействие хлорокина, вещества продлевающего жизнь C. elegans и короткоживущих мышиных моделей прогерии, усиливает активность ATM (Qian et al., 2018). В ответ на ионизирующее излучение и повреждение ДНК ATM фосфорилирует сотни белков, включая факторы сплайсинга семейств hnRNP и SR (Matsuoka et al., 2007). Генетический нокдаун ATM влияет на уровень экспрессии многих SF: SRSF1, SRSF2, SRSF3, SRSF7, TRA2β, HNRNPD, HNRNPA1 и LSM14A (Holly et al., 2013).

PRMT5 — еще один белок, связывающий репарацию двухцепочечных разрывов ДНК, старение и сплайсинг. PRMT5 — N-метилтрансфераза, модифицирующая аргинины гистонов и компонент сплайсосом SmB, SmD3 и SmD3. В то время как
активность PRMT5 необходима для поддержания стволовых клеток, ингибирование PRMT5 усиливает накопление мутаций, сенесценцию и старение (Blanc & Richard, 2017). С возрастом происходит снижение уровней PRMT5 в семенниках, тимусе, почках, легких и сердце у 24-месячных крыс в сравнении с 6-месячными (Hong et al., 2012).
При делеции PRMT5 наблюдаются 579 событий альтернативного сплайсинга, главным образом происходит удержания интронов и пропуски экзонов, в том числе в генах MDM4 и MDM2 — негативных регуляторов p53, также нарушается сплайсинг модификаторов гистонов KMT6/EZH2, KMT1E/SETDB1, KMT5C/SUV4-20H2, TIP60/KAT5 и фактора репарации ДНК TIP60/KAT5 (Hamard et al., 2018).

PARP1 — представитель семейства факторов репарации одноцепочечных разрывов ДНК. Активность PARP1 в мононуклеарных клетках периферической крови коррелирует с продолжительностью жизни 13 видов млекопитающих и снижается с возрастом как у людей, так и у грызунов (Grube & Burkle, 1992).
PARP1 также участвует в сплайсинге: он связывается с РНК, факторами сплайсинга и хроматином и может выступать как регуляторный хаб, обеспечивающие ко-транскрипционный сплайсинг. Кроме того, он может регулировать выбор сайтов сплайсинга за счет регуляции скорости движения РНК-полимеразы II при транскрипции, так, например, слабый сайт сплайсинга может использоваться с большей вероятностью, если сразу после него произошла задержка РНК-полимеразы и сильный сайт еще не транскрибирован. И наконец, PARP1 связывается с компонентом сплайсосом SF3B1 и стабилизирует SF3B1-нуклеосомный комплекс (Matveeva et al., 2019).

(Hamard et al., 2018). Снижение выживаемости клеточных линий при увеличении концентрации ингибитора PRMT5.
11
Воспаление и сплайсинг.
При старении происходит снижение адаптивного иммунитета и развитие хронического воспаления, не связанного с инфекциями. При хроническом воспалении также происходит повышение окислительного стресса, который стимулирует дальнейшее развитие воспаления (Liguori et al., 2018). Это воспаление вносит вклад в развитие старческих заболеваний и характеризуется повышением C-реактивного белка и IL-6, который сдвигает паттерн сплайсинга BCL2L1 в сторону образования про-апоптозной изоформы BCL-xS (Li et al., 2004).

Некоторые механизмы иммунной активации реализуются через сплайсинг, так при активации происходит сдвиг сплайс изоформ цитокинов, поверхностных рецепторов, адаптерных белков (CD3, CD28, CD8, CTLA-4, MAP4K2, MAP3K7, MAP2K7, CD45, VAV1) и других молекул, участвующих в иммунном ответе (Rotival et al., 2019).

12
Хроническое воспаление и сплайс-изоформы.
При старении увеличивается риск развития хронического воспаления и связанных нейродегенеративных заболеваний, например, болезни Альцгеймера, которую ниже мы рассмотрим подробнее.

Одно из хронических аутоиммунных воспалительных заболеваний — рассеянный склероз — ассоциирован с изменением сплайсинга рецептора интерликина 7 — ILR7, при пропуске 6-го экзона которого образуется секретируемая форма рецептора — sIL7R. Альтернативный сплайсинг ILR7 контролируется фактором DDX39B, который сам по себе находится в аллеле, ассоциированном с риском рассеянного склероза. Повышение концентрации sIL7R в крови коррелирует с тяжестью заболевания в мышиных моделях рассеянного склероза (Lundstrom et al., 2013). Интересно, что экспрессия мембранно-связанной формы IL7R связана со старением, Leiden Longevity Study показало снижение с возрастом уровней IL7R, при этом более высокие уровни IL7R в зрелом возрасте могут отражать более молодой биологический возраст и лучшее состояние здоровью (Passtoors et al., 2015).

С воспалением в нервной системе также связан альтернативный сплайсинг белка клеточной адгезии CADM1, его изоформа CADM1d усиливает взаимодействие нервных и тучных клеток иммунной системы, что обеспечивает воспалительный процесс в нервных тканях и мозге (Shakola et al., 2015). Ген CADM1d обладает разным статусом метилирования в молодых и старых кроветворных стволовых клетках (Sun et al., 2014).

13
Эпигенетика и сплайсинг.
Метилирование ДНК.

Метилирование ДНК в 5-ой позиции цитозина у млекопитающих чаще всего происходит в CpG островках — участках ДНК богатых CpG динуклеотидами, такие регионы часто встречаются в промоторных областях генов. Гиперметилирование промоторных участков способствует снижению экспрессии гена, в то время как гиперметилирование тела гена усиливает его экспрессию (Li & Zhang, 2014). С возрастом и при возрастных заболеваниях профиль метилирования ДНК менятеся: геномное метилирование вне CpG островков уменьшается, а метилирование промоторных участков усиливается (Maegawa et al., 2010). Интересно, что эпигенетические часы Хорвата — алгоритм, предсказывающий хронологический возраст на основании 353 CpG островков, опирается на участки зачастую связанные с сайтами сплайсинга, в настоящее время не известна причинно-следственная связь и ее направление между метилированием этих островков и сплайсингом, однако, между ними прослеживаются закономерности (Malousi et al., 2018). Так, снижение метилирование ДНК ведет к изменению профилей сплайсинга в человеческих и мышиных клетках in vitro (Li-Byarlay et al., 2013; Yearim et al., 2015). Также во многих тканях и видах организмов экзонные последовательности заметилированы сильнее окружающих их интронов (Gelfman et al., 2013). В-третьих альтернативно сплайсируемые экзоны метилированы слабее постоянно включенных в транскрипт (Gelfman et al., 2013), в то же время их уровень метилирования выше пропускающихся экзонов (Song et al., 2017).

Существуют две гипотезы о воздействии метилирования на сплайсинг, согласно первой метилирование привлекает факторы слайсинга SF, согласно второй — метилирование влияет на кинетику РНК-полимеразы и транскрипции, параллельно которой проходит сплайсинг. В случае замедления РНК-полимеразы может использоваться слабый сайт, пока сильный еще не транскрибирован (Iannone & Valcarcel, 2013).

Модификации гистонов.

Метилирование, ацетилирование и другие модификации гистонов меняются с возрастом, при старении хроматин в целом приобретает более открытую конформацию, из-за усиления ацетилирования гистонов, в том числе вследствие снижения экспрессии деацетилазы SIRT1 (Gong et al., 2014). Нокдаун SIRT1 в нейрональных стволовых клетках приводит к дифференциальной экспрессии 440 экзонов, многие гены которых участвуют в контроле клеточного цикла и репарации ДНК (Wang, et al., 2018). Снижение уровней гистонов H2B и H3 приводит к увеличению скорости элонгации транскрипции, что также влияет на профили альтернативного сплайсинга (Jimeno-Gonzalez et al., 2015).

При этом ферменты, участвующие в ацетилировании гистонов сами подвергаются альтернативному сплайсингу, так SIRT1 под действием фактора SRSF2 может экспрессироваться с пропущенным 8-ым экзоном, эта короткая изоформа имеет меньшую деацетилазную активность и индуцируется p53 при стрессовых воздействиях. Эта же изоформа SIRT1-ΔExon8 в свою очередь сама подавляет экспрессию p53 (Lynch et al., 2010).

Метилированные гистоны могут участвовать в построении комплексов пре-мРНК и факторов сплайсинга. Внутренние экзоны показывают повышенные уровни связи с нуклеосомами, богатыми H3K36me3 — трижды метилированным по лизину 36 гистону 3, привлекающего факторы сплайсинга такие как SRSF1 через адаптерный белок p52. H3K36me3 также связан со старением. Подавление активности метилтрансферазы met-1 снижает уровни H3K36me3 и укорачивает продолжительность жизни C. elegans (Pu et al., 2015).

Связь между сплайсингом и эпигенетической регуляцией может быть двусторонней: метилированные гистоны привлекают факторы сплайсинга, и в то же время они сами и их регуляторы подвергаются альтернативному сплайсингу, от которого таким образом зависит расположение эпигенетических меток в геноме (de Almeida et al., 2011; Kim et al., 2011).
14
Нейродегенеративные заболевания.
В мозге наблюдаются уникальные паттерны альтернативного сплайсинга и экспрессируются специфичные для него SF, сплайсинг участвует в созревании и дифференциации клеток, миграции нейронов, росте аксонов и синаптогенезе (Weyn-Vanhentenryck et al., 2018). Сплайсинг также связан с развитием нейродегенеративных заболеваний.

Некоторые специфические сплайс-изоформы были обнаружены у пациентов с болезнью Альцгеймера и модельных организмов. Например,как минимум 4 изоформы может иметь транскрипт гена BACE, кодирующий β-секретазу, ключевой фермент, деградирующий белок предшественник амилоида с образованием β-амилоида, формирующего бляшки в мозге пациентов (Fisette et al., 2012), профили экспрессии этих сплайс-изоформ отличаются в молодых и старых мышах (Stilling et al., 2014).

При исследовании болезни Альцгеймера на выборке в 450 человек выявили 84 события альтернативного сплайсинга в том числе среди генов, про участие которых в патогенез было известно. Так альтернативно сплайсируются гены фосфофруктокиназы PFKP, α/β-гидролазы NDRG2 и предшественника бета-амилоида APP (Mitchelmore et al., 2004; Tollervey, Wang, et al., 2011, Raj et al., 2018). Были определены и новые гены: протеинкиназа 2 бета PTK2B, PICALM, ген шаперона CLU. Сайты сплайсинга найденных геновы обогащены сайтами РНК-связываемых белков PTBP1, HNRNPC, CPSF7 и ELAVL1 (Raj et al., 2018). Примечательно, что факторы сплайсинга PTBP1 и SRSF1 также регулируют сплайсинг CD33 с образованием изоформы ассоциированной с риском болезни Альцгеймера (van Bergeijk et al., 2019).

В развитие болезни Альцгеймера вовлечены и мутации, вызывающие события альтернативного сплайсинга. Более 50% наследуемых форм болезни Альцгеймера ассоциированы с мутациями генов пресенилинов 1 и 2. Это трансмембранные белки, входящие в протеазный комплекс γ-секретазы. (D. Campion et al., 1995). Мутации в экзонах 4 и 9 пресенилина 1 ведут к ассоциированным с болезнью Альцгеймера изоформам с пропусками соответствующих экзонов 4 и 9 (C. Tysoe et al, 1998; J. Perez-Tur et al., 1995). Мутация в 5-ом экзоне пресенилина 2 вызывает пропуск экзона в транскрипте, что также встречается в случаях болезни Альцгеймера. Эта же изоформа белка экспрессируется при гипоксии, по крайней мере in vitro: культура клеток нейробластомы, лишенная этой мутации, в ответ на гипоксию, но не другие клеточные стрессы, производит укороченную форму белка пресенилина 2. Индуцированный гипоксией альтернативный сплайсинг блокируется добавлением в среду культивирования антиоксидантов, таких как N-ацетилцистеин, что позволяет предположить, что альтернативный сплайсинг, индуцированный гипоксией может вносить вклад в развитие болезни Альцгеймера (Sato et al., 2002). Более того, известно, что образование бляшек β-амилодиа в мозге усиливается после ишемического стресса (Zhang et al., 1997).

Эти исследования позволяют предположить, что пертурбации альтернативного сплайсинга при развитии болезни Альцгеймера происходят не из-за общего сбоя сплайсосом, а в результате воспроизводимых эффектов специфических генов.

15
Сплайсинг, старение и рак
Возраст является самым большим риск-фактором развития онкологических заболеваний, 60% онкологических больных имеют возраст 65 и более лет (de Magalhaes, 2013). Рак и старение разделяют общие биомаркеры — геномную нестабильность, эпигенетические изменения, нарушения метаболизма и его сигнальных каскадов и клеточную сенесценцию (Aunan et al., 2017). Для рака и старения свойственны и изменения в профилей сплайсинга и дизрегуляция его аппарата, которая происходит вследствие мутаций факторов сплайсинга и изменений экспрессии необходимых для него белков. Для старения также характерно накопление мутаций.

Мутации в сплайсосомных генах SF3B1, U2AF1 и SRSF2 встречаются в некоторых видах рака, чаще всего при миелодиспластическом синдроме и лейкемии, мутации в SF3B1 и SRSF2 как правило не встречаются одновременно, т. к. ведут к слишком большим нарушениям в сплайсинге, по отдельности они затрагивают большое количество генов, в частности нарушается NFκB сигнальный путь (Lee et al., 2018).
В твердых опухолях чаще наблюдается не мутации, а альтерации уровней экспрессии факторов сплайсинг, например, при изменение копийности генов. SF связываются с пре-мРНК и регулируют сплайсинг в дозозависимых формах (Urbanski et al., 2018). Повышенная активность SR факторов ассоциирована с раком молочной железы, их экспрессия растет вследствие увеличения копийности либо при мутациях в их транскрипционных факторах, таких как онкоген MYC (Anczukow et al., 2012; Park et al., 2019). Две трети случаев рака молочной железы возникают в возрасте более 50 лет (Shapiro, et al., 2019). Механизм действия повышения SR факторов, однако остается малоизученным.

16
Миелодиспластический синдром (MDS).
MDS — группа гематологических заболеваний, при которых предшественники клеток крови не полностью дифференцируются в костном могзе, при этом может наблюдаться анемия, частые инфекционные заболевания и, в некоторых случаях, миелоидный лейкоз.

Мутации в сплайсосомных белках SF3B1, SRSF2, U2AF1 и ZRSR2 встречаются у более половины больных MDS. MDS является патологией старшей возрастной группы, большинство из них старше 55 лет, в детском и молодом возрасте встречается крайне редко.

Механизм воздействия мутаций SF на альтернативный сплайсинг и MDS не полностью изучен, однако известно, что мышиная модель с короткими теломерами, одних из маркеров старения, воспроизводит симптомы MDS. Низкая активность теломеразы ассоциирована со сниженным уровнем факторов сплайсинга, мутации в которых наблюдаются у больных MDS - SRSF2, U2AF2, SF3B2 и SF3A3. Предшественники клеток крови при этом производят нефункциональные транскрипты белков, участвующих в репарации ДНК и поддержании структуры хроматина. Один из таких белков — метилтрансфераза DNMT3a, мутация в которой приводит к быстрой лейкимии у больных MDS (Walter et al., 2011; Colla et al., 2015).
Chabot & Shkreta, 2016
Альтернативный сплайсинг как мишень для терапии
При старении в разных тканях и клетках модельных организмов и человека происходят изменения профилей альтернативного сплайсинга и экспрессии факторов сплайсинга, которые связаны также с возраст-зависимыми заболеваниями и биомаркерами старения. Неизвестно накапливаются ли изменения в сплайсинге постепенно или это носит взрывной характер при получении некоторых сигналов, возникающих вследствие старения. Пока что неизвестны все механизмы регуляции альтернативного сплайсинга, неизвестно является ли старение последствием или драйвером, или, отчасти, и тем и другим для изменений в альтернативном сплайсинге.
Несмотря на это, альтернативный сплайсинг вносит вклад в развитие возраст-зависимых заболевание и может быть мишенью для их профилактики и терапии
Существуют несколько методов воздействия на альтернативный сплайсинг:

1) Применение низкомолекулярных веществ в качестве интерфейсов между молекулой пре-мРНК и малой ядерной РНК сплайсосомы. Направление сплайсосомы к нужному сайту сплайсинга (Palacino et al., 2015).

2) Применение антисенс олигонуклеотидов (ASOs), связывающихся со специфичными последовательностями пре-мРНК и стерически-блокирующих доступ сплайсосом к сайтам сплайсинга. ASOs при этом выступают «переключателем» сплайсига. Олигонуклеотиды химически модифицируются для повышения их стабильности (Kole at al., 2012).

3) Сплайсосом-опосредованный транс-сплайсинг (SMaRT), позволяющий скомбинировать 2 отдельные молекулы пре-мРНК: искусственно созданную и эндогенную, сплайсирующуюся с ошибками (Puttaraju et al., 1999).

4) Модуляция факторов сплайсинга (Yang Y et al., 2011, Tanaka H et al., 2018). Например, гомологи ресвератрола, продлевающего жизнь модельных, повышают экспрессию центральных факторв сплайсинга, снижающихся при старении (Latorre et al., 2017).

5) Редактирование мутаций на границах интрона и экзона для узнавания сломанного сайта сплайсинга (Konermann S et al., 2018; Yuan J et al., 2018; Gapinske M et al., 2018).

1
Низкомолекулярные вещества как интерфейс между сплайсосомой и пре-мРНК
Palacino et al., 2015
В клинической практике используется способ воздействия на выбор сайта сплайснига с помощью низкомолекулярных веществ. Этот метод применяется при лечении спинальной мышечной атрофии — тяжелого наследственного заболевания, вызванного мутацией в гене SMN1, необходимого для функционирования синапсов моторных нейронов.
Мутация всего одного нуклеотида в 7-ом экзоне SMN1 приводит к образованию альтернативного нефункционального транскрипта, в котором 7-ой экзон вырезается вместе с окружающими его интронами.

В настоящее время тестируются и применяются низкомолекулярные вещества Risdiplam и Branaplam, взаимодействующие с последовательностью 7-го экзона пре-мРНК и обеспечивающие стабилизацию двойной спирали пре-мРНК и РНК U1-компонента сплайсосом, что приводит к включению 7-го экзона в транскрипт (Palacino et al., 2015). Механизм действия этих веществ еще не полностью изучен. Branaplam также предложен для лечения болезни Хантингтона (Singh et al., 2020).

Таким образом мы видим возможность коррекции сплайсинга с помощью низкомолекулярных веществ, что может использоваться и для борьбы со старением.
Palacino et al., 2015; Singh et al., 2020
2
Применение антисенс олигонуклеотидов (ASOs)
Преждевременное старение может вызываться прогерией (синдромом Хатчинсона — Гилфорда), обусловленного точечной мутацией гена LMNA, необходимого для функционирования ядерной мембраны. Мутация активирует скрытый 5' — сайта сплайсинга в 11-ом экзоне, что приводит к укорочению транскрипта и дальнейшему неправильному созреванию белка (Sandre-Giovannoli et al., 2003).

Укороченная форма ламина A получила собственное название — прогерин.

Для in vitro восстановления нормального сплайсинга ламина A применялся метод антисенс олигонуклеотидов (ASOs): используется 25-мерный олигонуклеотид, стерически блокирующий сайт альтернативного сплайсинга, что позволило снизить количество прогерина и восстановить здоровый фенотип клеток фибробластов, полученных от пациентов с прогерией (Scaffidi & Misteli, 2006). In vivo испытания антисенс олигонуклеотидов проводились на трансгенных мышах с мутацией LMNA и также показали свою эффективность (Osorio et al., 2011; Harhouri et al., 2016).

Scaffidi et al., 2005; Coutinho et al., 2009
При обычном старении с возрастом также нарастает экспрессия укороченной формы ламина A, по видимому вызванная не мутацией, а нарушением механизма регуляции сплайсинга и предпочтением более слабого 5' — сайта сплайсинга (Scaffidi & Misteli, 2006). Применение ASOs может оказаться полезным для борьбы с признаками старения.

Метод ASOs применяется in vivo на мышиных моделях болезни Альцгеймера для модуляции сплайсинга APP — предшественника амилоида, образующего бляшки в головном мозге. ASO блокирует включение 17-экзона, содержащего эндопротеолитический сайт γ-секретазы, в результате чего APP не разрезается γ-секретазой и β-амилоид не образуется (Chang JL et al., 2018).

Аналогичным образом ASO блокирует взаимодействие с фактором SRSF1 и предотвращает исключение 19-го экзона в транскрипте APOER2, кодирующего рецептор аполипопротеина E, вовлеченного в долгосрочное обучение и образование памяти. Если цитоплазматический домен, кодируемый 19-ым экзоном, остается в APOER2, то сохраняется Reelin/Psd-95-сигнальный путь, защищающий от β-амилоидной токсичности (Hinrich AJ et al., 2016).

Особенно важно, что эффект введения ASO модельным животным в желудочки мозга сохраняется в течение длительного времени — в плоть до 6 месяцев с экспрессией «правильных» изоформ белков. Метод ASO, однако, связан с клеточной токсичностью и нуждается в дальнейших доработках, поэтому была реализована альтернативные стратегия, основанная на транс-сплайсинге — методе SMaRT.
Biamonti et al., 2019
3
Сплайсосом-опосредованный транс-сплайсинг (SMaRT)
Обычный, цис-сплайсиг, состоит в вырезании интронов и сшивании экзонов одной и той же пре-мРНК, в ходе транс-сплайсинга сшиваются экзоны двух разных молекул пре-мРНК.

Метод сплайсосом-опосредованного транс-сплайсинга (SMaRT) (Puttaraju et al., 1999) позволяет скомбинировать экзогенную пре-транс-сплайсинг молекулу РНК (PTM), искусственно введенную в организм, и эндогенную пре-мРНК в единую химерную молекулу. PTM гибридизуется с полипиримидиновой последовательностью интрона у 3’SS и, в зависимости от ориентации, экзон PTM может заменить 3’-экзон, 5’-экзон, и даже внутренний экзон пре-мРНК.
Berger et al., 2016
Методом SMaRT можно корректировать мутации — часть преМРНК заменяется PTM без мутации. Это применяется при муковисцидозе, болезни Хантингтона и пигментной дистрофии сетчатки (Berger et al., 2016).

SMaRT может также скорректировать ошибку сплайсинга.

При болезни Альцгеймера, а также лобно-височной деменции и паркинсонизме в ходе альтернативного сплайсинга гена MAPT вырезается 10-ый экзон пре-мРНК белка Tau, кодирующий домен связывания с микротрубочками. Исключение 10-го экзона приводит к дисбалансу изоформ и возникновению скоплений внутриклеточных нейрофибриллярных клубков гиперфосфориллированного белка Tau, которые наравне с бляшками β-амилоида являются маркерами болезни Альцгеймера (Ittner LM et al., 2011).

Доставка PTM с экзонами 10-13 в клетки нейронов in vitro или с помощью инъекций лентивируса в мозг трансгенных мышей in vivo показали эффективное включение 10-го экзона в транскрипта Tau, что приводит к восстановлению его растворимости и степени фосфорилирования, а также когнитивных функций модельных животных (Rodriguez-Martin et al, 2005; Avale et al., 2013; Espíndola et., 2018).

Как стратегию альтернативную SMaRT рассматривали сверхэкспрессию нормальной, полной, формы белка tau, однако это приводило к слишком высоким уровням Tau и выраженной токсичности (Ishihara et al., 1999). При репрограммировании же сплайсинга Tau методом SMaRT общий эндогенный уровень его экспрессии остается неизменным.
Biamonti et al., 2019
Выводы о современных методических трудностях исследования сплайсинга
Возможности анализа опубликованных данных о сплайсинге в настоящее время ограничены рядом технических и концептуальных трудностей: во-первых в разных работах используются разные технологии и вычислительные методы для детекции изменений профилей альтернативного сплайсинга, во-вторых нет точного и унифицированного определения «молодых» и «старых» доноров, важным фактором также является число временных точек в исследовании, в-третьих интерпретация данных модельных организмов и перенос закономерностей на человека затруднительны, ведь у человека альтернативно сплайсируются более 90% генов, в сравнение с ~65% у мышей и ~25% у червей, более того даже для одного вида разные ткани отличаются профилями альтернативного сплайсинга при развитии и старении. И наконец, большая часть анализа экспрессии на сегодняшний день сделана для общей, тотальной РНК образцов, что не учитывает клеточный состав ткани, различия в разных клеточных типах и изменения их пропорций в ткани при старении, для решения этой проблемы необходимо секвенирование единичных клеток.