Меню
научный обзор
Митохондриальная медицина.
Часть 3
Часть 3
Ольга Борисова
15 декабря 2019
15 декабря 2019
Микробиом как способ воздействия на митохондрии
Взаимодействие микробиом-митохондрии сейчас в топе научных интересов не только с теоретической точки зрения, но и как потенциальный способ повлиять на наши митохондрии при помощи модификации микробиома. Главное тут понять, кто на кого как влияет. Микробиом влияет на все аспекты нашей физиологии и играет ключевую роль в становлении возраст-зависимых заболеваний.
Микробиом коммуницирует с митохондриями на языке метаболитов. Микробиом конвертирует сигналы окружающей среды и компоненты рациона в сигнальные метаболиты, влияющие на своего хозяина. Но мы находимся только на начальных ступенях изучения влияния микробиома на митохондрии.
Микробиом коммуницирует с митохондриями на языке метаболитов. Микробиом конвертирует сигналы окружающей среды и компоненты рациона в сигнальные метаболиты, влияющие на своего хозяина. Но мы находимся только на начальных ступенях изучения влияния микробиома на митохондрии.
Что мы знаем про микробиом и метаболиты микробиома:
1
Оксид азота, NO, ингибирует Цикл трикарбоновых кислот, снижая образование ацетил-КоА.
2
Сероводород, H2S, в высоких концентрациях ингибирует комплекс IV дыхательной цепи.
2
КЦЖК, SCFA, особенно бутират, являются «топливом» для дыхательной цепи. Бутират стимулирует биогенез митохондрий. Кроме этого, они могут приводить к высвобождению антивоспалительных цитокинов, Il10 и сигнальный гормон, GLP1, снижая поглощение энергии.
Еще одним важным метаболитом микробиома, влияющим на митохондрии, является уролитин. Уролитин А — это метаболит, образуемый некоторыми бактериями кишечника из эллаговой кислоты (содержится в гранатах, малине, виски, орехах и др.). Применение уролитина А у «пожилых» грызунов способствовало росту показателей выносливости и силы мышц, без увеличения их массы, приводило к увеличению количества митохондрий.
На культуре клеток было показано, что использование уролитина А запускало процесс митофагии (источник). Сейчас проходят клинические испытания на здоровых пожилых добровольцах, которые показали безопасность его применения (источник 1, источник 2, источник 3).
На культуре клеток было показано, что использование уролитина А запускало процесс митофагии (источник). Сейчас проходят клинические испытания на здоровых пожилых добровольцах, которые показали безопасность его применения (источник 1, источник 2, источник 3).
Использование различных групп антиоксидантов
Если раньше, согласно теории Хармана, ROS считали главной причиной старения и причиной всевозможных повреждений, сейчас мы знаем, что это не совсем так. У здоровых людей использование антиоксидантов может снижать показатели адаптации, что мы видим при использовании антиоксидантов у спортсменов. Поэтому эффективность использования антиоксидантов в значительной мере зависит от выбранной группы.
Рисунок 1
Целесообразность использования антиоксидантов в различных возрастных группах
Целесообразность использования антиоксидантов в различных возрастных группах
Антиоксиданты могут снижать оксидативный стресс, но они не влияют на производство АТФ и на работу дыхательной цепи.
К антиоксидантам относятся различные антиоксиданты общего действия (витамин Е, витамин С и т.д.) и таргетные антиоксиданты, направленные непосредственно на митохондрии. Самым известным из таргетных антиоксидантов, пожалуй, является MitoQ. Он может проходить через двойную мембрану митохондрий, воздействуя непосредственно в месте образования свободных радикалов. Однако, данное соединение не проникает в деполяризованные митохондрии. На искусственных моделях старения MitoQ показывает стандартно хорошие результаты, на естественных, — не всегда. Но вот в данном исследовании улучшал сосудистую функцию у пожилых (источник).
К антиоксидантам относятся различные антиоксиданты общего действия (витамин Е, витамин С и т.д.) и таргетные антиоксиданты, направленные непосредственно на митохондрии. Самым известным из таргетных антиоксидантов, пожалуй, является MitoQ. Он может проходить через двойную мембрану митохондрий, воздействуя непосредственно в месте образования свободных радикалов. Однако, данное соединение не проникает в деполяризованные митохондрии. На искусственных моделях старения MitoQ показывает стандартно хорошие результаты, на естественных, — не всегда. Но вот в данном исследовании улучшал сосудистую функцию у пожилых (источник).
Другим интересным классом соединений, которые оказывают своеобразное антиоксидантное воздействие, являются препараты ингибиторы ренин-ангиотензиновой системы и АПФ (эналаприл, рамиприл), а также сартаны (блокаторы рецептора ангиотензина 1-го типа) (источник). Главным эффектом ангиотензина является сужение сосудов.
Так как это влияет на дыхание митохондрий, то логично, что митохондрии имеют рецепторы к ангиотензину. Интересно, что митохондрии имеют 2 класса рецепторов ангиотензина, с различным биохимическим каскадом воздействия.
Рецептор АТ-2 снижает митохондриальное дыхание, не влияя на биоэнергетику и не приводя к увеличению концентрации ROS. Если же ангиотензин связывается с АТ1, то образуется супероксид-анион.
Так как это влияет на дыхание митохондрий, то логично, что митохондрии имеют рецепторы к ангиотензину. Интересно, что митохондрии имеют 2 класса рецепторов ангиотензина, с различным биохимическим каскадом воздействия.
Рецептор АТ-2 снижает митохондриальное дыхание, не влияя на биоэнергетику и не приводя к увеличению концентрации ROS. Если же ангиотензин связывается с АТ1, то образуется супероксид-анион.
Рисунок 2
На митохондриях находятся 2 типа рецепторов к ангиотензину (источник)
На митохондриях находятся 2 типа рецепторов к ангиотензину (источник)
Известно, что активность этой системы с возрастом растет. Помимо этого, падает количество рецепторов АТ2 (источник). В связи с этим, ангиотензин через АТ1-рецептор вызывает митохондриальную дисфункцию. Поэтому ингибиторы АПФ (эналаприл, рамиприл и т. д.) и блокаторы рецептора ангиотензина 1-го типа (БРА) — сартаны (телмисартан, валсартан, лозартан и т. д.) — оказывают антиоксидантное воздействие.
Генное редактирование митохондриальных геномов
В то время как методы генной терапии мутаций ядерной ДНК развиваются довольно активно (особенно — для моногенных заболеваний), с митохондриями все гораздо сложнее. Дисфункция наступает только тогда, когда количество митохондрий с мутацией преодолевает некоторую пороговую черту.
Мы не можем исправить мутацию во всех митохондриях — в клетке их слишком много. Большая честь методов генной терапии направлена на изменение соотношения мутантные/нормальные митохондрии.
Мы не можем исправить мутацию во всех митохондриях — в клетке их слишком много. Большая честь методов генной терапии направлена на изменение соотношения мутантные/нормальные митохондрии.
Поэтому практически все методы генной терапии митохондрий направлены не на коррекцию мутантных генов, а на таргетную (направленную) деградацию ДНК в митохондриях с мутацией (Gene cleaving tools), что изменит соотношение МХ в сторону НЕмутантных. Данное направление носит название антигеномное и антирепликативное (при помощи данного способа мы разрушаем ДНК и устраняем нежелательные для нас митохондрии).
Видео на тему редактирования митохондриальных геномов — https://www.youtube.com/watch?v=Jh06y19Y7W0.
Видео на тему редактирования митохондриальных геномов — https://www.youtube.com/watch?v=Jh06y19Y7W0.
В данном направлении различают несколько методических подходов, которые мы коротко опишем с указанием их основных преимуществ и недостатков.
Использование ДНК-нуклеаз
Данный метод предполагает использование генноинженерных конструктов, которые кодируют сайт-специфичные ДНК нуклеазы (ферменты, которые расщепляют нуклеиновые кислоты строго в определенной точке — сайте), нацеленные на митохондрии.
Их можно использовать для прицельного удаления последовательности мтДНК с мутацией, что изменяет соотношение гетероплазмии (мутантные митохондрии/здоровые митохондрии) в сторону здоровых. То есть в ядерный геном при помощи вектора (аденовирусного или другого) вносится ген, который кодирует специфический фермент.
Их можно использовать для прицельного удаления последовательности мтДНК с мутацией, что изменяет соотношение гетероплазмии (мутантные митохондрии/здоровые митохондрии) в сторону здоровых. То есть в ядерный геном при помощи вектора (аденовирусного или другого) вносится ген, который кодирует специфический фермент.
Если в митохондриальном геноме возникает мутация и появляется специфическая последовательность кода, то фермент разрезает такую митохондриальную ДНК и такая митохондрия с большой вероятностью элиминируется (или попросту убивается).
Такие опыты проводились на культурах гепатоцитов мыши: использование генной терапии позволяло изменить уровень гетероплазмии за 6 часов. In vivo такой метод испытывали на мышиной модели при помощи внесения аденовирусного вектора. При этом экспрессия эндонуклеаз рестрикции (кодируемых внесенным генноинженерным вектором), направленных на митохондрии, эффективно изменяла уровень гетероплазмии в сторону желаемого варианта (здоровых митохондрий) и была относительно безопасным методом (Bayona-Bafaluy et al, 2005; Bacman et al, 2010, 2012 ссылка).
Такие опыты проводились на культурах гепатоцитов мыши: использование генной терапии позволяло изменить уровень гетероплазмии за 6 часов. In vivo такой метод испытывали на мышиной модели при помощи внесения аденовирусного вектора. При этом экспрессия эндонуклеаз рестрикции (кодируемых внесенным генноинженерным вектором), направленных на митохондрии, эффективно изменяла уровень гетероплазмии в сторону желаемого варианта (здоровых митохондрий) и была относительно безопасным методом (Bayona-Bafaluy et al, 2005; Bacman et al, 2010, 2012 ссылка).
Недостатки метода: сложно найти ту мишень (последовательность), которая будет присутствовать только в мутантных митохондриях и не будет — в здоровых. Для более чем 200 мутаций мтДНК, ассоциированных с заболеваниями, только у двух обнаружен селективный таргет (та единственная и неповторимая последовательность) для возможного использования такого подхода.
Создание Zn-finger ДНК-связывающихся модулей (mitoZFN)
Инженерные «цинковые пальцы» zinc finger nucleases (ZFNs) — это химерные ферменты, содержащие две структурные единицы, одна из которых катализирует расщепление ДНК, а вторая способна избирательно связываться с определенными нуклеотидными последовательностями в составе целевой молекулы. То есть одна единица связывается с «нужной» последовательностью, а вторая — ее расщепляет.
Этот метод широко использовался и для редактирования ядерных геномов, но был вытеснен CRISPR Cas технологией.
А вот для митохондриального геномного редактирования он по-прежнему широко применим.
Этот метод широко использовался и для редактирования ядерных геномов, но был вытеснен CRISPR Cas технологией.
А вот для митохондриального геномного редактирования он по-прежнему широко применим.
Такие модули были созданы для практически всех 64 нуклеотидных комбинаций кодонов. Для удобства распознавания и последующего удаления к такому модулю можно добавить специфический флажок, облегчающий распознавание нужной последовательности — метильную метку (в данном случае это DNMT3 метилтрансфераза). Тогда на таргетный для модуля нуклеотид прицепится метильная метка. Такой нуклеотид будет гораздо проще распознать для таргетного удаления. Поэтому такая комбинация (модуль mitoZFN, направленный на какую-то последовательность + генный конструкт со специфической нуклеазой, которая будет этот модуль узнавать и расщеплять) позволяет таргетно убирать специфические последовательности мтДНК.
Такой модуль испытывался на клеточных линиях с мутацией Т8993G (данная мутация ассоциирована с синдром Лея, нейропатией, атаксией и т.д), и в результате происходило изменение соотношения в сторону мтДНК «дикого типа» (без мутации). Что интересно — экспрессия нескольких комбинаций специфичных CD-specific mtZFNs использовалась также для элиминации «частой делеции» 4977-bp в культуре клеток.
Такой модуль испытывался на клеточных линиях с мутацией Т8993G (данная мутация ассоциирована с синдром Лея, нейропатией, атаксией и т.д), и в результате происходило изменение соотношения в сторону мтДНК «дикого типа» (без мутации). Что интересно — экспрессия нескольких комбинаций специфичных CD-specific mtZFNs использовалась также для элиминации «частой делеции» 4977-bp в культуре клеток.
Рисунок 3
Генная терапия митохондрий при помощи «цинковых пальцев» zinc finger nucleases (ZFNs), разрушающих мутантные копии митохондриальной ДНК, изменяя уровень гетероплазмии
Генная терапия митохондрий при помощи «цинковых пальцев» zinc finger nucleases (ZFNs), разрушающих мутантные копии митохондриальной ДНК, изменяя уровень гетероплазмии
Данная делеция ассоциирована с офтальмоплегией и накапливается у всех людей в различных тканях в процессе старения. Особенно высоким уровнем делеции у человека характеризуются ткани мозга. Данная делеция потенциально является важным маркеров возрастной митохондриальной дисфункции.
Согласно полученным результатам, авторам удалось снизить уровень патологичного mtDNA гаплотипа ниже порогового уровня. Последующая репопуляция wild-type mtDNA приводила к существенному восстановлению OXPHOS функции в обработанных клетках.
Недостатки метода: тяжело доставить большое количество модулей внутрь митохондрии, существуют не для всех кодонов.
Согласно полученным результатам, авторам удалось снизить уровень патологичного mtDNA гаплотипа ниже порогового уровня. Последующая репопуляция wild-type mtDNA приводила к существенному восстановлению OXPHOS функции в обработанных клетках.
Недостатки метода: тяжело доставить большое количество модулей внутрь митохондрии, существуют не для всех кодонов.
mitoTALENs (transcription activator-like effector nucleases)
Более перспективным средством избирательного воздействия на ДНК могут быть конструкции на основе химерных нуклеаз, названные TALENs (от Transcription Activator-like Effector Nucleases) (Sanjana et al., 2012). Роль ДНК-распознающих структур в них играют белковые домены, каждый из которых «узнает» только один нуклеотид. Природным прототипом таких доменов явились белки (TAL-effectors) некоторых бактерий, паразитирующих в клетках сельскохозяйственных растений.
При этом подходе нуклеазы могут определять отдельные нуклеотиды, обеспечивая связывание и расщепление практически любой последовательности, если только она начинается с тимидина.
Этот подход успешно применялся для изменения уровня гетероплазмии в ооцитах мыши и на культуре клеток. На культуре клеток были разработаны mitoTALENs, нацеленные на два относительно частых патогенных варианта точечных мутаций: m.8344A>G tRNALys (ассоциирована с миоклональной эпилепсией) и m.13513G>A ND5 (MELAS/Leigh синдром) (источник).
Этот подход успешно применялся для изменения уровня гетероплазмии в ооцитах мыши и на культуре клеток. На культуре клеток были разработаны mitoTALENs, нацеленные на два относительно частых патогенных варианта точечных мутаций: m.8344A>G tRNALys (ассоциирована с миоклональной эпилепсией) и m.13513G>A ND5 (MELAS/Leigh синдром) (источник).
Такой подход также использовался на мышиной модели гетероплазмичной митохондриальной мутации. В этом исследовании AAV9-mitoTALEN вводили внутримышечно, внутривенно и интраперионального. При этом в мышцах и сердце уровень мутантной мтДНК существенно снижался и эффект был стабилен. Молекулярный дефект, а именно снижение уровня RNAAla, был успешно исправлен таким лечением (источник).
Недостатки метода: тяжело доставить большое количество модулей внутрь митохондрии, вектор может быть слишком большой.
Недостатки метода: тяжело доставить большое количество модулей внутрь митохондрии, вектор может быть слишком большой.
CRISPR-Cas9
Данная методика, получившая широкое распространение для редактирования ядерного генома и, фактически, совершив революцию в этой области, все еще имеет ограничения для редактирования митохондриального генома.
С ним есть сложности, так как проблематично доставить направляющую РНК внутрь митохондрии, более того, в митохондриях низкий уровень репарационных процессов NHEJ и HR.
Недостаток всей этой группы методов — возможность снизить общее количество мтДНК ниже функционального порогового уровня, что усугубит проблему митохондриальной дисфункции и может привести к апоптозу клетки.
Недостаток всей этой группы методов — возможность снизить общее количество мтДНК ниже функционального порогового уровня, что усугубит проблему митохондриальной дисфункции и может привести к апоптозу клетки.
Митохондриальная терапия
На сегодня методы лечения митохондриальных заболеваний, в основном, консервативные. В то же время, при значительной степени митохондриальной дисфункции (при наличии врожденных митохондриальных заболеваний) данные подходы не обеспечивают решения проблемы. Нормальная работа митохондрий нарушается не только при митохондриальных заболеваниях, но также при болезни Альцгеймера, Паркинсона, при диабете, саркопении, инсулин-резистентности, при таких состояниях как инсульт, инфаркт миокарда, при старении организма.
При этом доставка новых митохондрий или восстановление их пула может иметь терапевтический эффект. По словам Chu-Yuan Chang, 2019, новая парадигма митохондриальной терапии основана на стратегии доставки органелл. Для трансфера могут использоваться аутологичные митохондрии (из клеток того же организма) либо гетерологичные (изолированные из клеток других организмов).
При этом доставка новых митохондрий или восстановление их пула может иметь терапевтический эффект. По словам Chu-Yuan Chang, 2019, новая парадигма митохондриальной терапии основана на стратегии доставки органелл. Для трансфера могут использоваться аутологичные митохондрии (из клеток того же организма) либо гетерологичные (изолированные из клеток других организмов).
Трансфер митохондрий способен решить 2 основные проблемы возрастной митохондриальной дисфункции: увеличить количество «хороших» митохондрий до порогового уровня, необходимого для нормальной работы клетки; стимулировать митофагию — гетероплазмия (наличие генетически разнородных митохондрий в клетке) усиливает «внутренний контроль качества».
Необходимо ответить, что in vivo трансфер митохондрий от клетки к клетке является нормальным и довольно распространенным процессом. Клетки в нашем организме могут обмениваться мтДНК (в составе экзосом, микровезикул, апоптотических телец) и даже передавать другим клеткам целые митохондрии (при помощи микровезикул и туннельных нанотрубочек).
Показано, что донорами митохондрий могут быть мезенхимальные стволовые клетки, фибробласты, астроциты, активированные тромбоциты и некоторые другие типы клеток (источник).
Трансфер митохондрий in vivo выполняет целый ряд физиологических функций:
Трансфер митохондрий in vivo выполняет целый ряд физиологических функций:
- «Спасение» клетки от апоптоза при ее повреждении (например, астроциты «спасают» нейроны);
- Перепрограммирование клеток и их дифференцировка;
- Влияние на иммунные процессы (увеличение фагоцитарного сродства иммунных клеток).
Что касается искусственного трансфера митохондрий, тут можно выделить 2 основных подхода:
1. Mitochondrial augmentation therapy
Ее принцип состоит в том, что выделенные (аутологичные или гетерологичные митохондрии) тем или иным способом (Caicedo, 2017) in vitro вводятся в изолированные из организма клетки. После этого эти обогащенные митохондриями клетки вводятся обратно в организм.
Терапия обогащения митохондриями ооцитов при бесплодии использовалась довольно широко, при этом брали донорские митохондрии. То есть в протоколе искусственного оплодотворения в ооцит, полученный у женщины с проблемами с зачатием, вводили фрагмент цитоплазмы с митохондриями молодой женщины. Результаты были довольно хорошие, но в 2005 году FDA запретила этот протокол, ввиду недостаточно изученного риска митохондриальной гетероплазмии. Сейчас используется oocyte augmentation therapy с аутологичными митохондриями, полученными из предшественников половых клеток (clinical trial-NCT02586298).
Терапия обогащения митохондриями ооцитов при бесплодии использовалась довольно широко, при этом брали донорские митохондрии. То есть в протоколе искусственного оплодотворения в ооцит, полученный у женщины с проблемами с зачатием, вводили фрагмент цитоплазмы с митохондриями молодой женщины. Результаты были довольно хорошие, но в 2005 году FDA запретила этот протокол, ввиду недостаточно изученного риска митохондриальной гетероплазмии. Сейчас используется oocyte augmentation therapy с аутологичными митохондриями, полученными из предшественников половых клеток (clinical trial-NCT02586298).
Рисунок 4
Принцип mitochondrial augmentation therapy (из презентации https://www.youtube.com/watch?v=_jgWIvpRC54&t=2s)
Принцип mitochondrial augmentation therapy (из презентации https://www.youtube.com/watch?v=_jgWIvpRC54&t=2s)
Для лечения митохондриальных заболеваний данный подход использует и запатентовала компания Minovia (Израиль). Пока в исследование было вовлечено 5 пациентов с синдромом Пирсона (источник).
2. Трансфер выделенных изолированных митохондрий в ткань или системно в кровоток.
Большая часть исследований проводилась на крысах и кроликах. Трансфер митохондрий успешно использовали для лечения ишемии сердца, постинсультных состояний, острого повреждения легких. На животных моделях использовали как аутологичные митохондрии, так и митохондрии от других особей и даже видов (источник).
Митохондриальная терапия показала многообещающие результаты при различных патологиях: ишемия миокарда, болезнь Паркинсона, при острой печеночной недостаточности (источник 1, источник 2, источник 3).
Митохондриальная терапия показала многообещающие результаты при различных патологиях: ишемия миокарда, болезнь Паркинсона, при острой печеночной недостаточности (источник 1, источник 2, источник 3).
Рисунок 5
Способы введения изолированных митохондрий (из презентации https://www.youtube.com/watch?v=_jgWIvpRC54&t=2s)
Способы введения изолированных митохондрий (из презентации https://www.youtube.com/watch?v=_jgWIvpRC54&t=2s)
Трансфер аутологичных митохондрий был успешно осуществлен у детей с врожденным пороком сердца: «На небольшой группе детей был показан низкий уровень побочных эффектов и высокий уровень эффективности процедуры». Врачи, работающие над данной терапией, утверждают, что в ближайшее время данная технология может быть внедрена как стандартный терапевтический подход в случае внезапного массивного повреждения тканевых митохондрий, в частности, в случаях ишемии (McCully, 2017; Cowan, 2016; Masuzawa, 2013).
Трансплантация митохондрий представляет собой новую парадигму терапевтических интервенций, способствующих выживанию и регенерации нейронов при нейродегенеративных заболеваниях, инсультах, повреждениях ЦНС. В данном обзоре представлены основные направления развития митохондриальной терапии (Chu-Yuan Chang, 2019).
Трансплантация митохондрий представляет собой новую парадигму терапевтических интервенций, способствующих выживанию и регенерации нейронов при нейродегенеративных заболеваниях, инсультах, повреждениях ЦНС. В данном обзоре представлены основные направления развития митохондриальной терапии (Chu-Yuan Chang, 2019).
Развитие данной терапии требует решения еще многих вопросов:
- Оценить влияние системного и локального введения на биомаркеры старения на животных моделях.
- Изучить вопрос: будет ли нормально реплицироваться ДНК пересаженных митохондрий, будут ли они способны к нормальному делению, либо же они могут использоваться только как экстренная терапия.
- Методологические вопросы: стандартизация процедуры изоляции митохондрий, подбор оптимальных концентраций для инъекции, тестирование сред, методики оценки качества и целостности митохондрий, использования переносчиков.
- Выбор оптимального источника (клеток и тканей) для получения митохондрий.
Часть 2
Митохондриальная медицина. Часть 2
Методики поддержания функции митохондрий: консервативные и инновационные подходы.
Что-то другое
Как инвестиции в биотех могут спасти вашу жизнь, но это не точно
Fibrocell, Forbius, Genzyme, Regulus, Fibrogen и Foresee. Мы не знаем, как не запутаться во всех этих Fib' и For', но кое в чём разобрались.
Присоединяйтесь к обсуждению