Очень важно понимать, что реакции в человеческом организме хоть и отлажены как часовой механизм, на самом деле протекают далеко не идеально. Вследствие этого происходят повреждения, незначительные по отдельности, но способные накапливаться на протяжении всей жизни. Тело человека никогда не было рассчитано на бессмертное существование. Поэтому патологические процессы, результат которых заметен лишь по прошествии десятков лет, контролируются хуже других. Человеческий организм к противодействию данному типу повреждений оказывается не готов. В связи с этим такие процессы стали очень интересны науке. Одно из них — неферментативное гликозилирование, которое также именуется «гликирование».
Что такое гликирование?
Гликирование — это каскад реакций, начинающихся с присоединения присутствующих в организме на постоянной основе сахаров или их производных к различным биологическим молекулам (в том к числе ДНК, липидам, и в особенности белкам). Наибольшую опасность этот процесс представляет для белков межклеточного матрикса. В состав межклеточного матрикса входят фибриллярные белки, в том числе коллагены, фибронектин, ламинины и эластин, протеогликаны, гликозаминогликаны, гликопротеины, а также, факторы роста, цитокины и ферменты, ремоделирующие матрикс. Разные белки имеют различную скорость обновления. Дольше всего живут те, что выполняют функции каркаса тканей и испытывающие определенные физические нагрузки (например, фибриллярные коллагены).На протяжении всего своего существования белки матрикса подвергаются гликированию. Поскольку они живут долго, а гликирование — тоже очень долгий процесс, то оба фактора складываются, создавая все условия для образования конечных продуктов реакции, также именуемых «конечные продукты гликирования» (КПГ). Для того, чтобы полностью исключить гликирование, нам бы пришлось изменить фундаментальную природу нашего метаболизма, которая построена на зависимости от углеводов, окислительного фосфорилирования и в меньшей степени гликолиза, структурообразующей природы протеинов и т. д. С помощью указанных биохимических путей глюкоза распадается и происходит образование макроэргических молекул (АТФ), заключающих в своих химических связях необходимую для существования нашего тела энергию, потому остановить эти реакции невозможно. А без матрикса, в состав которого и входят длительно существующие белки, чрезвычайно осложнены были бы такие процессы, как взаимодействие клеток, их миграция в тканях, и даже дифференцировка.
Гликирование разнообразно, в него могут вступать не только моносахара. Более быстрым и опасным (хоть и менее распространенным) вариантом гликирования считается реакция, в которой в качестве гликирующего вещества выступают не сахара, а их производные. Некоторые виды таких молекул образуются или в ходе упомянутого гликолиза, или же при окислении сахаров в присутствии активных форм кислорода (АФК), или следовых количеств d-металлов (медь, цинк и др.). К таким соединениям относятся глиоксаль, метилглиоксаль, дезоксиглюкозон и др. (Рис. 1). Их также называют «карбонильные соединения», за наличие в их структуре карбонильных групп, порой двух, расположенных при этом на соседних атомах углерода.
По способности вступить в реакцию гликирования такие агенты значительно превосходят привычную нам глюкозу. Так, если проводить сравнение различных гликирующих веществ, то окажется, что глюкоза в этом ряду — самая безопасная молекула. Возможно, именно поэтому она стала основным эволюционно отобранным источником энергообеспечения организма среди прочих моносахаров. Фруктоза же (употребление которой часто связывают со здоровым питанием) гликирует белки в 3−5 раз активнее глюкозы. А упомянутый ранее метилглиоксаль превосходит глюкозу по активности в 20 000 раз!
Рассмотрим подробнее субстраты, подвергающиеся гликированию. В основу различных белков входят комбинации из 19 аминокислот (глицин, лейцин, тирозин, серин, глутаминовая кислота, глутамин, аспарагиновая кислота, аспарагин, фенилаланин, аланин, лизин, аргинин, гистидин, цистеин, валин, триптофан, изолейцин, метионин, треонин), иминокислоты (пролин), а также некоторых модифицированных амино/иминокислот (гидроксипролин, гидрокилизин), и каждая кислота имеет свой собственный остаток (боковую цепь) со своими особенностями. К таким «особенностям» относятся заряд, способность к химическому взаимодействию и т. д., и благодаря сумме этих «особенностей» комбинации аминокислот в белках придают им определенные свойства, обуславливают их конформацию, растворимость и т. д. Благодаря этим же особенностям некоторые аминокислоты в значительно большей степени уязвимы к действию гликирующих агентов и формируют ковалентные связи с ними легче всего. Обычно это лизин и аргинин, хотя в некоторых случаях в реакцию гликирования может вступать и другая аминокислота, например N-концевой валин при образовании гликированного гемоглобина. Такое присоединение является инициаторным для реакции гликирования, однако на этом всё не заканчивается, и до образования конечного продукта промежуточным продуктам надлежит пройти стадии гемиаминаля, основания Шиффа, енаминола, продукта Амадори, эндиола, глюкозона Ледерера (или пентозона Ледерера). Последний затем подвергается внутримолекулярной конденсации между аминогруппой и концевой альдегидной функциональной группой, что позволяет сформироваться положительно заряженному кольцевому соединению, называемому циклическим бета-кетоиминиевым ионом (6 или 7-членным), и он уже, реагируя с гуанидиновой группой аргинина, образует сложные и устойчивые поперечные сшивки, такие как глюкозопан или пентозидин. Это КПГ, и удалить из матрикса их чрезвычайно сложно, проще недопустить протекание реакции гликирования. Также стоит отметить, что далеко не все КПГ формируют такую сшивку между двумя белками (например, один из наиболее распространенных КПГ — карбоксиметиллизин — не сшивает белки между собой).
Итак, мы можем защищать аминокислоты от реакции гликирования. Для примера мы можем препятствовать присоединению гликирующих агентов к аминокислотным остаткам. Такой способностью обладает известный всем аспирин (ацетилсалициловая кислота). Пару механизмов, благодаря которым аспирин проявляет данную способность, мы приводим на Рис. 2, на котором отображен химизм процесса защиты аминогруппы белка.
Как сказано выше, в случае, если присоединение все-таки произошло, то в ходе нескольких промежуточных реакций образуются ранние продукты гликирования, к которым причисляются гемиаминали, основания Шиффа и др. Скорость их появления зависит от вида исходного гликирующего агента (глюкоза, фруктоза, карбонильные соединения и др.). Естественно, что такая интервенция способна повлиять на базовые биофизические характеристики поврежденного белка, и может оказаться достаточной для изменения некоторых биологических свойств (нарушение конформации, снижение функции — последнее может быть характерно не столько для белков матрикса, сколько для антител или ферментов). Такое изменение логично, ведь атакованы и подвергнуты химическому преобразованию боковые цепи аминокислот первичной аминокислотной последовательности, влияющие на организацию исходного белка. Первые получаемые в ходе гликирования продукты (гемиаминали, основания Шиффа, энаминолы и др.), пока еще нестабильны и могут деградировать.
В этот момент на реакцию гликирования еще можно воздействовать фармакологически и таким образом замедлить ее протекание. Например, при помощи отделения ранних продуктов гликирования от белка (трансгликирующее действие, также иногда именуемое дегликирующим, Рис. 3), или притормозить их дальнейшее образование. Предполагается, что дегликирующее действие оказывают глутатион, таурин, пеницилламин и др. [1, 2, 3].
Если этого не сделать, то ранние продукты гликирования трансформируются в более стабильные продукты Амадори, или распадутся на упомянутые ранее карбонильные соединения. А образование карбонильных соединений весьма нежелательно по причине их высокой способности повторно вступать в реакцию гликирования. Однако, на этом этапе на реакцию все еще можно повлиять либо связывая последние, либо замедляя «созревание» продуктов Амадори и их дальнейшую трансформацию. Соединения, замедляющие дальнейшие превращения продуктов Амадори носят название «амадорины» [4].
Конечная стадия реакции гликирования — образование химически различающихся, но очень стабильных молекул, которые и именуются КПГ. Среди них выделяют:
- производные гидроимидазолона (MG-H),
- имидазола (MOLD, FFI),
- тетрагидропиримидина (аргпиримидин),
- нафтиридина (кросслайн, флуоролинк),
- имидазопиридина (пентозидин),
- пирролопиридин (весперлизины А, В, С),
- лизил-пирролиридина (одноименный КПГ) и др., всего их более 20 [5].
КПГ могут различаться по структуре: быть циклическими или нециклическими, иметь в своей структуре конденсированные ароматические гетероатомные кольца и т. д. Некоторые КПГ могут флуоресцировать. К слову говоря, на этом явлении основаны методы прогноза сердечно-сосудистых рисков при заболеваниях, связанных с повышенным образованием КПГ (при этом с помощью специального прибора, называемого AGE-reader, происходит количественное измерение величины аутофлуоресценции кожи), что также можно положить в основу определения биологического возраста.
Как было сказано, в ходе формирования КПГ иногда образуют ковалентные связи не с одной макромолекулой белка, к которой ранее присоединился моносахарид, а с двумя. В этом случае принято говорить о том, что сформировалась поперечная сшивка гликированных белков. Поперечной ее называют потому, что она связывает между собой два остатка аминокислот, отстоящих в стороны относительно центральной полипептидной цепочки белка, и располагается «перпендикулярно» ей. К КПГ, образующим такие сшивки, относится и самая распространенный из них — глюкозепан.
Гликирование в коже
Итак, гликирование — крайне медленная реакция, протекающая в организме человека всю жизнь. С возрастом она все глубже изменяет физические и микросредовые свойства межклеточного матрикса. Белки с низкой скоростью обновления, такие как коллаген, а также долгоживущие белки, такие как фибронектин — это основные мишени реакции гликирования в коже.Поврежденный таким образом коллаген проявляется на коже в виде морщин, дряблости, отека и обесцвечивания (Рис. 4). Гликирование и поперечное сшивание долгоживущих белков матрикса кожи приводят к внешне наблюдаемым проявлениям старения.
Коллаген — один из важнейших структурных белков матрикса — имеет довольно большие размеры и длину. Когда коллагеновые волокна сшиваются друг с другом, происходит ряд событий:
- Волокна становятся твердыми и жесткими;
- Изменяется перенос питательных веществ и отходов, а также циркуляция жидкости;
- Нарушается движение клеток в матриксе.
Невидимым для глаз свойством матрикса, который очень важен для нормального самочувствия клеток — «живых элементов» кожи, считается повышение жесткости, снижение эластичности и изменение его ультраструктурной организации. Клетки оказываются столь восприимчивыми к его физическим свойствам, что это влияет на их дальнейшую судьбу в отношении пути дифференцирования. Или, проще говоря, пути выбора профессиональной специализации клетки.
Как организм борется с гликированием?
Организм сопротивляется процессу гликирования, но механизмы, выработанные эволюционно с целью противодействия ему, недостаточно совершенны и могут не справиться, вероятность чего выше в более позднем возрасте. Новая для этих механизмов задача — поддержание нормальной функции матрикса в пожилом возрасте и при числе накопленных повреждений, с которым на эволюционном пути их закладки эти механизмы еще не сталкивались. Это отсылает нас к ранее озвученному тезису о том, что результат протекания некоторых патобиохимических процессов становится заметен лишь через десятки лет, то есть в возрасте, до которого наши далекие эволюционные предки могли не доживать.Естественные механизмы борьбы с гликированием в организме включают в себя:
- Глиоксалазную (GLO1 и 2) систему.
- Дегликазную систему.
Еще один механизм противодействия гликированию — работа фермента-дегликазы PARK7. Функции этого белка включают в себя антиоксидантое и шапероноподобное действия (шапероны — своеобразные реставраторы белков в том случае, если те оказались повреждены). Гликирование связано не только с изменениями кожи, но и с нейро-дегенеративными болезнями. Так, с мутациями PARK7 связывают 1−2% случаев раннего начала болезни Паркинсона (что и дало начало названию белка). Логичным выглядит и то, что болезни такого типа носят говорящее название «конформационные болезни мозга».
Однако стоит отметить, что оба механизма защиты (как связанный с гликоксалазами, так и с дегликазами) влияют на условно обратимые этапы гликирования. Это те этапы, когда сформированный продукт реакции еще не успел дозреть, приобретя высокую степень инертности, стабильность и невосприимчивость к различным ферментам. Иначе говоря, такой продукт, образование которого подавляет указанная защита, — это еще не КПГ. С КПГ дела обстоят гораздо сложнее.
Конечные продукты можно представить как невосстановимые области матрикса, и механизма для его разрушения у человека просто нет. Тем удивительнее выглядит тот факт, что источниками их образования чаще всего становится жизненно необходимый человеку нутриент глюкоза. Возвращаясь к коже, стоит отметить, что именно разрушением межклеточного матрикса и начинают заниматься клетки после того, как в нем произошли такие грубые изменения, как образование КПГ. В ходе этого ферменты, деградирующие матрикс, начинают продуцироваться усиленно. К таким относятся некоторые матриксные металлопротеиназы (внеклеточные эндопептидазы). Наращивая свое присутствие в межклеточном матриксе (а вернее изменяя соотношение фракций путем роста одних изотипов ферментов и снижения количества других), эти ферменты рушат матрикс, чем вколачивают большой ржавый гвоздь в и без того полузакрытую крышку гроба красоты и здоровья кожи. А все потому, что у человека недостает механизмов, благодаря которым можно было бы продуцировать элементы разрушенного матрикса. Причем делать это так, чтобы новые структурные элементы, имея качественный и количественный состав полностью идентичный молодому, собирались в организме (и, в частности, в коже) правильным образом. Такая задача со стороны организма выглядит не многим проще строительства Эйфелевой башни. Отчасти потому матрикс кожи старого человека можно представить как руины большого мегаполиса, в которых доживают свой век остатки выживших людей (клеток) (рис 5).
Гликирование как причина утраты молодости и здоровья
Накопление КПГ можно представить, как некое накопление ошибок протеома, возникающее в ходе старения. На процесс гликирования можно взглянуть с позиций повышения неупорядоченности белковой организации. Организм стареет поэтапно. Достигая очередной возрастной ступени, начинается процесс, в ходе которого страдают функции внутренних органов, чаще возникают болезни, растет риск смерти. Можно предположить, что, когда количество изменений достигает критического порога, происходит резкая утрата здоровья. Гликирование в подобную модель вписывается чрезвычайно гармонично. Так, если смотреть на гликирование как на механизм патогенеза старения, то реакции это последовательность событий, реализуемых по законам энтропии и ведущих к молекулярному изнашиванию белков (особенно изнашиванию белков межклеточного матрикса). За этим следует ответ на эти реакции со стороны организма, а ввиду несовершенства регенеративных и защитных механизмов, этот ответ не противодействует старению, а усугубляет его течение. Элементы этого ответа (изменение активности сиртулинов, воспаление и т. д.) исследователями принимается порой за первичный механизм старения, и порой факт связи с нарушением работы межклеточного матрикса по причине гликирования остается неустановленным. Таким образом, молекулярное изнашивание матрикса вследствии гликирования может быть пусковым фактором, запускающим дальнейшие события патогенеза старения (что, впрочем, еще не доказано, но является вполне жизнеспособной гипотезой), и процесс старения можно и нужно контролировать, защищая организм от первопричин этого изнашивания, к которым относится гликирование.Надо понимать, что борьба за молодость и здоровье матрикса должна вестись не только на поле самого матрикса, но и на полях обитающих в нем клеток. Недавние исследования показали [8], что препятствование образованию рубцового коллагена в комбинации с коктейлем вспомогательных средств (подавляющих воспаление и стимулирующих рост сосудов и нервов), помогло восстановить ранее ампутированную конечность африканской шпорцевой лягушке, не способной к массивной регенерации такого типа (как и человек). Естественно, в человеческом организме воссоздать подобное вряд ли возможно, но это подводит нас к важному предположению: регенеративные возможности организма поддаются регуляции, и, возможно, мы сумеем запустить регенерацию тканей на ультраструктурном уровне, восстанавливая изнутри области накапливающих повреждения стареющих тканей.
Учитывая крайнюю сложность репарации поврежденных гликированием белков и их сверхвысокую продолжительность жизни, этот процесс следовало бы сочетать с радикальной и избирательной деструкцией элементов состаренного матрикса, накопивших нерепарируемые изменения (например, несущих множество поперечных сшивок). В особенности это касается таких сверхдолгожителей, как коллагены хрящей (период полураспада до 117 лет) и коллагены кожи (период полураспада порядка 10 лет).
Что касается усиления продукции и корректной укладки нового матрикса, то процесс можно было бы запустить, регулируя активность генов и эпигенетическим «омолаживанием» клеток. Сегодня подобное может казаться фантазией, но нет ничего невыполнимого в мире идей.
Какие же перспективы?
Пока что возможности фармакотерапии старения в рамках человеческого организма довольствуются малым и весьма ограничены. Мы имеем возможность контролировать процесс гликирования, однако мы еще не научились обращать накопленные изменения вспять. В череде попыток взять под контроль непослушные поперечные сшивки был разработан препарат Alagebrium (ранее известный как соединение ALT-711). Вещество претендовало на то, чтобы позиционироваться как разрушитель поперечных сшивок гликированных белков, и разрабатывалось Alteon, Inc. Алагебриум был первым в своем классе, и одним из первых был клинически протестирован для борьбы с поперечными сшивками, возникающими в тканях человека [9].Показав интригующий результат на этапе исследования механизма действия in vitro и в ряде животных моделей, алагебриум на десятилетие стал основным ориентиром для направленного дизайна новых молекул-разрушителей сшивок. Однако в то время представление о поперечных сшивках гликированных белков было не таким, как сейчас. Ученое сообщество полагало, что сшивки представлены линейными углеродными цепочками, содержащими дикарбонильные фрагменты. Эти участки могли быть атакованы алагебриумом благодаря его высокой нуклеофильности, после чего через ряд промежуточных стадий происходил разрыв углерод-углеродной связи.
В наше время уже давно известно, что подавляющее число сшивок в матриксе, в том числе в коже, представлено такими сложными структурами, как глюкозепан, пентозидин и т. д. По этой причине алагебриум более не рассматривается как расшиватель. Однако по-прежнему интересна его способность препятствовать трансформированию поздних продуктов гликирования (карбонил-содержаших глюкозонов и др.) в конечные продукты, что все еще чрезвычайно важно для тех матриксных структур, обновление которых можно запустить в пожилом возрасте. Таким образом, направленная разработка соединений на основе алагебриума приобретает новую задачу — создание класса соединений, стимулирующих восстановление функций мягких возобновляемых матриксов за счет снижения КПГ-нагрузки в этих матриксах. Такие матриксы — это, например, базальные мембраны сосудов, стромальные компоненты органов и др. Такие потенциальные соединения можно рассматривать как имеющие независимую полезность, так и в качестве подготовки для последующей клетка-ориентированной омолаживающей терапии.
В завершение стоит отметить, что опасность для человека представляют не только КПГ, образуемые в среде человеческого организма, но и употребляемые с пищей. Примером реакции гликирования, наблюдаемой в ходе готовки являются жарка мяса или выпечка хлеба, в ходе которых возникает типичный запах, цвет и вкус приготовления пищи. Количество КПГ в пище в основном зависит от способа ее приготовления. Например, жареная пища содержит большее количество КПГ по сравнению с вареной пищей. Около 10−30% употребленных КПГ поглощаются организмом и могут участвовать в старении кожи. Кстати, чемпионом среди продуктов питания по количеству КПГ на 100 грамм продукта — это жаренный бекон (90 000 у.е.). Для сравнения, сырой цыпленок содержит 800 у.е., вареный 1000, а жареный уже 8000 [10]— различие в 10 раз. Исследования на эту тему указывают на то, что максимальное количество КПГ, потребляемое с пищей, не должно превышать 15 000 у.е. Выводы каждый способен сделать для себя сам. И даже если мы не станем первым поколением нестареющих людей, более долгая и здоровая жизнь принесет куда больше удовольствия.