Монстры, изменившие мир
Представьте себе картину из фильма-катастрофы: на Земле в результате генной рекомбинации появился вид бактерий, обитающий в солёных водоёмах и способный за счёт энергии Солнца высвобождать хлор из поваренной соли. Новая бактерия стремительно заселяет моря, и атмосфера заполняется токсичным хлором, убивающим всё живое. Небо из голубого становится грязно-зелёным. Сначала погибают люди и животные, затем настаёт черёд растений, грибов и большинства бактерий. Только некоторым из бактерий удаётся приспособиться к новым условиями: они учатся дышать хлором, как большинство из нас кислородом — перенося на него электроны по дыхательной цепи с образованием обыкновенной соли — хлорида натрия. Спустя миллиарды лет эти бактерии дадут начало новой жизни, которая будет полностью зависима от хлора.Такой сценарий может заставить содрогнуться человека с богатым воображением, но он позволяет наглядно проиллюстрировать масштабы и механизм развития катастрофы, разразившейся на нашей планете примерно два с половиной миллиарда лет назад. Близкие родственники ничем не примечательных бактерий, ныне обитающих в грязных стоячих водоёмах и в кишечнике некоторых млекопитающих, путём горизонтального переноса генов смогли «объединить» в своём геноме две фотосистемы — цепи переноса электронов при фотосинтезе. Ранее существовавшие виды бактерий использовали только какую-то одну. Соединение двух фотосистем позволило использовать в качестве источника электронов воду, которой вокруг было в буквальном смысле залейся, и тем самым избавить себя от экзистенциального вопроса, где же раздобыть сероводород или что-нибудь вроде него (и при этом остаться на свету). Но у этого процесса был один неприятный нюанс: в качестве побочного продукта выделялся кислород.
Аналогия с хлором не случайна. Кислород — сильнейший окислитель, в ряду электроотрицательности неметаллов он стоит сразу после фтора и перед хлором, то есть его химическая активность превосходит активность хлора. Поэтому, если руководствоваться чисто химической логикой, для любой живой материи кислород страшнее хлора. Что такое хлор, хорошо описал английский поэт Уилфред Оуэн в своём антивоенном стихотворении «Dulce et Decorum Est»:
Согнувшись, как бродяги под мешками,
Мы шли вразброд пустыми большаками,
Надрывно кашляя наперебой,
И спины озарял пылавший бой.
Шли отсыпаться — под надежный кров,
Шли без сапог, сбивая ноги в кровь,
Шли в полусне, ступая наугад,
Не слыша взрывов газовых гранат.
«Газ! Газ! Скорей, ребята! К черту каски!
Напяливай резиновые маски!"
И кто-то, чуть замешкав в стороне,
Уже кричал и бился, как в огне.
Я видел сквозь зеленое стекло,
Как в мареве тонул он тяжело.
И до сих пор в моих кошмарных снах
Он в едких задыхается волнах.
О, если бы шагал ты за фургоном,
Где он лежал — притихшим, изнуренным,
И видел бы в мерцании зарниц,
Как вылезают бельма из глазниц,
И слышал бы через колесный скрип,
Как рвется из гортани смертный хрип,
Смердящий дух, горчащий, как бурьян,
От мерзких язв, кровоточащих ран —
Мой друг, ты не сказал бы никогда
Тем, кто охоч до ратного труда,
Мыслишку тривиальную одну:
Как смерть прекрасна за свою страну!
(Перевод Евгения Лукина)
Это стихотворение хорошо показывает, насколько ядовит хлор. Кислород, исходя из его химических свойств, должен быть ещё токсичнее, уступая только фтору, который тоже удостоился упоминания в стихах — а именно в поэме «Карбониада» Н. Славского:
Имя ему Муассан, не циклоп он, хотя одно око
Выжег ему, богоравному, Фтор, всегубящий галоид.
Окислительная способность хлора и фтора настолько велика, что в земной атмосфере этих газов нет в свободном виде. Нет их и на других планетах, атмосферы которых доступны нашему наблюдению — даже на таких адских, как, например, Венера. Всё, из-за сильнейшей окислительной способности, позволяющей газу прореагировать практически с любым восстановителем. На древней Земле кислорода тоже не было — ровно по той же причине. Современная земная атмосфера наполнена кислородом лишь благодаря постоянному пополнению его запасов либо цианобактериями, либо их «потомками» — пластидами, скрытыми в клетках растений и некоторых групп водорослей.
В своё время наполнение атмосферы кислородом стало настоящей вселенской катастрофой для тогдашней земной жизни. Ведь она зародилась в преимущественно восстановительной атмосфере, состоящей из углекислого газа, метана, водяного пара и некоторых других газов. По химическому составу эта атмосфера была похожа на современную атмосферу Марса и Венеры — с той лишь разницей, что её давление и температура примерно соответствовали современным. По идее, именно такая атмосфера оптимальна для существования органических соединений. Но тут её испортили цианобактерии со оксигенным фотосинтезом.
Трудно подсчитать, сколько видов тогда вымерло. Наверняка много. Но вся тогдашняя жизнь была представлена лишь бактериями и археями — а они по размеру в десятки раз меньше человеческого эритроцита и почти не оставляют окаменелостей. Однако погибли не все.
Части живших в те времена бактерий удалось выжить, не изменив своим биохимическим принципам. Их потомки нам теперь известны как анаэробы, и они, как и миллиарды лет назад, боятся кислорода как огня. Многие из них ныне обитают у нас в кишечнике. Тем более, что содержащиеся там газы по составу близки к атмосфере древней Земли. Мы, эукариоты, — потомки других групп организмов, которые были вынуждены приспосабливаться к новым условиям. Чтобы понять, как происходило это приспособление, разберёмся, как кислород повреждает клетки.
Активные формы кислорода
Особое коварство кислорода — в том, что он окисляет биомакромолекулы (белки, липиды, нуклеиновые кислоты) не только напрямую, но и опосредованно, в цепных реакциях. Живая клетка («с точки зрения» молекулы кислорода) просто набита разнообразными веществами, у которых можно легко отобрать парочку электронов, таких как флавопротеины и железо-серные белки. Они участвуют в окислительно-восстановительных реакциях, необходимых для жизнедеятельности клетки — и они же довольно лёгкая мишень для кислорода. кислород окисляет их, превращаясь в так называемые активные формы кислорода (АФК).Сам термин «активные формы кислорода» в огромной степени зонтичный и объединяет больше количество форм кислорода, проявляющих высокую реакционную способность и склонных реагировать с органическими веществами живой клетки. Их можно разделить на две больше группы:
- нерадикальные — не содержащие неспаренного электрона. Их молекулы условно могут считаться стабильными. Тем не менее, они отличаются высокой химической активностью в окислительно-восстановительных реакциях. К ним относятся гидропероксиды — пероксид водорода (H2O2) и органические гидропероксиды (RΟΟΗ), а также синглетный кислород (1 O2) и озон (O3);
- свободнорадикальные — содержат неспаренную пару электронов и поэтому представляют собой радикалы. Это супероксидный анион-радикал (O2·−), гидроксильный радикал, а также то, вот что они превращают органические вещества при встрече с ними — пероксильный радикал (ROO·) и алкоксильный радикал (RO·).
В клетках анаэробных бактерий кислород, окисляя флавиновые коферменты (производные витамина B2) и металлы в активных центрах ферментов, образует в основном супероксидный анион-радикал и перекись водорода. Помимо этого, кислород причиняет и другие неприятности — например, некоторые ферменты он просто необратимо инактивирует. Самый распространённый пример — нитрогеназа клубеньковых бактерий, которая позволяет им захватывать кислород из атмосферы. Кислород для неё настолько губителен, что растения вынуждены создавать для этих бактерий микроскопические «ванны» из связывающего кислород белка — дальнего «родственника» нашего гемоглобина.
Ризобии живут в корневых клубеньках растений, внутри клеток, называемых бактеорицитами. Инфицировав клетку, ризобии дифференцируются в бактероиды, заключённые внутри особых органелл — симбиосом. (В таком состоянии они очень напоминают митохондрии и хлоропласты — только те заперты в своём состоянии «бактероидов» навеки).
Бактероиды не могут фиксировать азот в присутствии кислорода, поэтому цитоплазма клетки-бактериоцита заполнена леггемоглобином — растительным белком, эволюционно родственным гемоглобину и миоглобину животных. Он связывает кислород, снижая его воздействие на бактероиды.
Активные формы кислорода запускают цепную реакцию, реагируя с молекулами липидов и превращая их в радикалы. Получившиеся химически активные формы липидов могут окислять другие липиды — и получается некая игра «передай рукавицы» на молекулярном уровне, только вместо рукавиц — неспаренный электрон на одном из атомов, электрический заряд или нестабильная группа атомов. Этот химический «пожар» будет продолжаться до того момента, пока в клетке не накопится достаточное количество «атакованных» липидов, и они не начнут реагировать друг с другом, обрывая цепь. Этот процесс получил название перекисное окисление липидов.
Помимо этого, АФК напрямую повреждают белки (нарушая их функцию), и, что самое страшное, ДНК клетки, вызывая в ней мутации. АФК — один из главных мутагенов клетки.
Вероятно, именно такое губительное действие кислорода на бактерии и археи, жившие более 2,5 миллиона лет назад, подтолкнуло некоторые из них к развитию биохимического аппарата утилизации опасного газа, который им впоследствии удалось связать с синтезом универсальной энергетической «валюты» клетки — АТФ. Так появилось дыхание. Потом однажды случилось эпохальное событие — анаэробный археон вступил в тесный симбиоз с такой научившейся дышать бактерией. Так появились мы — эукариоты. Сейчас эволюционисты склоняются к мысли, что исходно все эукариоты умели дышать. Да и многие умеют до сих пор — в том числе животные и растения. Мы — в каком-то роде многоклеточные экстремофилы, выросшие на пепелище кислородной катастрофы.
В самом деле, изобретение дыхания само по себе не так сильно помогло в борьбе к АФК. Проведение внутри клетки реакций с участием кислорода «в промышленных масштабах» приводит к неизбежной утечке активных форм кислорода из дыхательной цепи — от 3% до 5% потребляемого нами кислорода превращается в АФК. Это всё равно что из каждого барреля добываемой нефти от 5 до 8 литров превращались бы в химически неустойчивый газ, который на воздухе сразу взрывается. Во-первых АФК могут раньше времени «сбежать» из активного центра какого-нибудь фермента (особенно металлосодержащего), где они в норме образуются. Кроме того, в дыхательной цепи «опасные точки» — это комплексы I и III (всего в дыхательной цепи четыре комплекса). Между ними электрон переносит убихинон (тот самый коэнзим Q10 со знаменитой торговой маркой «Кудесан»), который по пути от комплекса к комплексу не прочь не донести свой электрон и отдать его кислороду (в норме кислород получает свои электроны только на комплексе IV). В общем, дыхание — тоже мина замедленного действия и постоянный источник АФК внутри нас.
«Жизнь — это просто дуэль со смертью» — пел Д’Артаньян в любимом всеми советском фильме. Эти слова как нельзя больше подходят к ситуации с АФК: мы не погибаем от них моментально лишь благодаря другим линиям защиты, постоянно их инактивирующим в режиме 24/7. Это прежде всего два основных фермента — супероксиддисмутаза и каталаза. Первый из них конвертирует супероксидный радикал в пероксид водорода и кислород, второй нейтрализует перекись водорода, разлагая её как воду и тот же самый кислород. Красивый химический опыт со вспениванием перекиси водорода при контакте со слюной человека показывает, насколько велика активность этого фермента в нашем организме. В том числе благодаря ей кислород не убивает нас сразу.
Помимо этих двух ферментов, в наших клетках существует универсальная «промокашка», удаляющая АФК — глутатион. Это короткий пептид из трёх аминокислот, содержащий тиольную (-SH)-группу на конце. Этой группой он восстанавливает активные формы кислорода, нейтрализуя их и окисляясь при этом сам. Его восстанавливает фермент глутатионредуктаза. Она получает восстановительные эквиваленты в виде НАДФH+ из постоянно действующих метаболических путей клетки — например, из пентозофосфатного пути, где в качестве восстановителя в конечном счёте используется глюкоза. Так что, в некотором роде «горькие» АФК в нашем организме «заедаются» сахаром.
Наконец, есть ещё одна линия защиты: витамины и витаминоподобные вещества с антиоксидантным действием. Это витамины C, Е и A, а также флавоноиды растительного происхождения, иногда условно объединяемые под названием «витамин P». Эти вещества — сильные восстановители, при этом они легко отдают электроны. Но важно понимать, что биохимически некорректно и даже нелепо считать их только антиоксидантами: активная форма витамина A обеспечивает нам работу органа зрения в составе белков опсинов, витамин C — кофермент в реакциях, за счет которых идет синтез нейромедиаторов и укрепление соединительной ткани (именно нарушение последней функции ведёт к развитию симптомов цинги при его отсутствии). Флавоноиды вообще обладают целым спектром биологических эффектов — наличие большого количества гидроксильных групп и «липкого» гидрофобного ядра позволяет им связываться с большим количеством ферментов и белков-рецепторов. Так что антиоксидантами они работают скорее по совместительству.
АФК и старение
Конечно, какое-то количество АФК постоянно прорывается через антиоксидантную защиту. На первый взгляд, резонно предположить, что именно они и приводят к постепенному изнашиванию тканей, внешне проявляющемуся как старение. Получится красиво: ядовитый кислород нас всё-таки убивает, хоть и медленно. Порочный круг планетарного масштаба и длиной в миллиарды лет замкнется.Свободнорадикальная теория старения, она же теория «wear and tear», скоро отметит свой 70-летний юбилей — она была впервые предложена Денэмом Харманом (Denham Harman) в 1956 году. Это довольно почтенный возраст даже для теории, однако растущий объём экспериментальных данных показывает, что молекулярное изнашивание имеет мало отношения к старению. Выше уже говорилось о том, что фермент супероксиддисмутаза очень важен для защиты от постоянно атакующих наши клетки АФК. Однако «выключение» у модельных животных гена, кодирующего этот фермент, не приводит к снижению продолжительности жизни, как это ни парадоксально! При этом с биохимической точки зрения эксперименты проведены корректно — черви Caenorhabditis elegans, насильственно лишённые супероксиддисмутазы, оказались особенно уязвимы к оксидативному стрессу. Но вот стареть быстрее не стали. Точно так же повышение уровня экспрессии этого фермента не увеличило червям продолжительность жизни.
Практически ровесник свободнорадикальной теории старения — миф об антиоксидантах. Тут тоже логика, на первый взгляд, понятна — если витамины A, C, и E — антиоксиданты, то нужно есть их как можно больше! И тогда стареть будешь медленнее. Этот короткий нарратив — опора для многих продавцов «антивозрастных» БАДов — начиная от витаминных комплексов и заканчивая другими антиоксидантами типа флавоноидов.
Однако такая прямая логика в современной медицине (в том числе профилактической) считается в некотором роде дурным тоном. Опираться на предполагаемое знание механизма развития патологии в назначении препарата слишком опасно — пример выше показывает, что иногда наши представления о нём бывают ошибочны. Поэтому любые профилактические или лечебные вмешательства принято проверять на эффективность и безопасность в клинических исследованиях — тщательно спланированных испытаниях на большой выборке пациентов с надлежащей обработкой данных и исключением возможных ошибок. Для повышения точности иногда несколько исследований статистически объединяют в одно — такое исследование называется метаанализом. Золотым стандартом считаются метаанализы Кокрановского сотрудничества.
В 2013 году Кокрановское сотрудничество опубликовало метаанализ клинических исследований по применению антиоксидантных пищевых добавок для снижения смертности, включающий почти 300 000 участников. Их выводы звучали даже несколько пугающе: антиоксидатные БАД не только не снижали смертность, но в некоторых случаях даже увеличивали её!
Либо свободнорадикальная теория старения не вполне верна, либо действуют какие-то другие факторы — но, как бы то ни было, приём антиоксидантов не помогает в борьбе со старением. В общем, пристальное изучение свободнорадикальной теории старения на уровне целостного организма (человека или животного) серьёзно поколебало её позиции. Скорее всего, химический «износ» от свободных радикалов — далеко не главная причина старения.
Но, может быть, в коже всё обстоит по-другому?
АФК и фотостарение
Кожа — это действительно особенная ткань. Большая часть тканей нашего тела существуют внутри нас — и в полной темноте. Единственные ткани, которые «видят» свет постоянно — это ткани глаз и кожа (вместе с её многочисленными производными, такими как волосы и ногти). В частности, кожа открыта воздействию ультрафиолетового излучения, обладающим мощным повреждающим действием из-за своей высокой энергии. Его проникающая способность невелика, но на толщину кожи её хватает вполне. Проходя через кожу, кванты (или фотоны) ультрафиолетового излучения сталкиваются с молекулами воды, при этом разбивая их на «осколки» — то есть те же самые АФК. Таков механизм непрямого действия любого ионизирующего излучения, и ультрафиолет — не исключение. Поэтому, в отличие от всех остальных тканей, кожа находится под усиленной оксидативной атакой:- в её клетках, как и в других тканях, митохондрии производят АФК в качестве побочного продукта дыхания;
- АФК образуются под влиянием ультрафиолетового излучения.
Ультрафиолетовое излучение способствует образованию АФК не только за счёт ионизирующего эффекта. В любых клетках, в том числе в клетках кожи, полно светопоглощающих молекул, называемых хромофорами: это все гемсодержащие молекулы (цитохромы и некоторые другие ферменты), порфирины и рибофлавин.
В ультрафиолетовом диапазоне гем или порфирины поглощают излучение аналогично тому, как это делает хлорофилл растений в видимом диапазоне — только электронтранспортной цепи, подходящей для быстрого «сбыта» этих электронов, у них нет. Поэтому электроны переносятся на кислород с образованием тех же АФК.
Интенсивность такой генерации АФК напрямую зависит от уровня облучения кожи ультрафиолетом и может достигать довольно высоких показателей. Уже после 15 минут воздействия ультрафиолетом в коже обнаруживаются H2O2 and OH• — их повышенные уровни сохраняются до часа. Поэтому свободнорадикальное повреждение кожи, по-видимому, играет роль в процессе фотостарения — старения под действием электромагнитного излучения.
Образуемые под действием ультрафиолетового излучения АФК напрямую повреждают белки, липиды и ДНК. Но АФК — это не только самостоятельные «боевые единицы», а ещё и довольно мощные сигнальные вещества. В клетках кожи они запускают воспалительную реакцию через активацию ключевых транскрипционных факторов — преимущественно AP-1 и NF-κB. Фактически, ультрафиолетовое излучение посредством АФК запускает в коже возрастное воспаление. В свою очередь, переход клеток кожи в «режим воспаления» активирует матриксные металлопротеазы (ММП), разрушающие межклеточный матрикс, составляющий основу дермы. Кроме того, из-за воспаления нарушается баланс цитокинов — и как следствие, синтез новых компонентов матрикса.
В итоге получается, что АФК в коже сразу «собирают» все признаки старения (hallmarks of aging): оксидативный стресс, возрастное воспаление, повреждение межклеточного матрикса и мутации генов. Фотостарение — настолько комплексный процесс, что ему у нас посвящена целая глава.
Так что там с геропротекцией?
Если геропротекция (в том числе антиоксидантами) на уровне всего организма остаётся довольно спорным вопросом, то в случае фотостарения всё чуть проще: очевидно, что здесь проблему можно свести к фотопротекции. А ей занимается каждый из нас, покупая солнцезащитный крем. Возникает закономерный вопрос: будет ли местное нанесение антиоксидантов усиливать фотопротекцию кожи? Этот вопрос имеет смысл не только в контексте старения, но и в контексте профилактики солнечных ожогов.Коллектив американских учёных посвятил этому вопросу критический обзор в Journal of the American Academy of Dermatology. Таких объёмных исследований, как в случае влияния антиоксидантов на смертность, для топических (то есть применяемых местно) антиоксидантов не проводилось, поэтому авторы изучали данные меньших по объёму исследований с разными конечными точками*.
*Конечная точка клинического исследования — это некий «результат» лечения, который оценивается в группе пациентов. Например, появление определённого симптома, выздоровление, выживаемость, смерть.
Витамин C (аскорбиновая кислота) в виде 1%-ного раствора оказался эффективен в защите от солнечных ожогов, а на молекулярном уровне — в активации синтеза коллагена и снижении активности ММП. Но увы, ему по чисто химическим причинам трудно «добраться» до дермы, где находятся живые клетки и межклеточный матрикс, которые он должен защищать. Это гидрофильная заряженная молекула, которая в заряженном состоянии плохо проходит роговой слой (stratum corneum). Чтобы улучшить её проникающую способность, можно прибегнуть к химической модификации, но тогда снизится антиоксидантная активность.
Довольно хорошей идеей оказалось комбинировать аскорбиновую кислоту с её биологическим агонистом — витамином E, или токоферолом. В этом случае фотопротективный эффект усиливается и появляется дополнительное действие: защита ДНК от повреждения, и, следовательно, снижение риска развития онкологических заболеваний кожи. Именно такая комбинация показала хорошую эффективность при добавлении в солнцезащитные кремы. Однако здесь на первый план выходит проблема доставки антиоксиданта в дерму и сохранения при этом его биологической активности. Кроме того, основные компоненты солнцезащитных кремов — соединения, поглощающие ультрафиолетовое излучения — должны, наоборот, иметь низкую проникающую способность и оставаться на поверхности рогового слоя, не проходя глубже. Это создаёт дополнительный конфликт требований к разным компонентам одного и того же продукта.
В итоге на данный момент не существует антиоксидантного средства, которое бы обладало мощным и надёжным эффектом в защите кожи от оксидативного повреждения и фотостарения. Несмотря на то, что в случае фотостарения такое средство возможно создать в теории — нет никаких очевидных биологических препятствий — пока все решения этой проблемы — это вариации на тему витаминов или ещё более нестабильных аналогов кофермента Q и цитокининов. Направленный дизайн и синтез принципиально нового антиоксиданта потребовал бы больших финансовых вложений, при этом он имел бы все шансы также оказаться фармакологически неэффективным. К тому же, как уже говорилось выше, свободнорадикальная теория старения подвергается всё большему сомнению, что должно снижать её инвестиционную привлекательность. Так что, если средство для радикального омоложения кожи и будет найдено, то далеко не факт, что его мишенью будут именно свободные радикалы.